[发明专利]基于血脂蛋白快速分离的脂质荧光检测技术

权利要求书

1.一种基于血脂蛋白快速分离的脂质荧光检测方法：包括如下步骤：

A.对分离柱定性：可知不同物质随着分子量的减少，其保留体积逐渐变大，不同大小物质的保留体积不同，将未知物质的保留体积与这些标准物质作对比从而对对位未知物的大小进行推测；

B.脂蛋白标准品保留体积的确定；

C.FPLC样品的准备：高速离心将待测血液样品中残留的血细胞去除，同时去除血清中游离的脂质；经过过滤后能除去一些大颗粒物质，

D.血清脂蛋白快速分离；

E.血清脂蛋白亚组分的收集；

F.AmplexRed法检测总胆固醇、游离胆固醇，绘制标准曲线；

G.AmplexRed法检测样品血清各收集管中总胆固醇、游离胆固醇；

H.利用公式“胆固醇酯浓度＝总胆固醇浓度-游离胆固醇浓度”，计算胆固醇酯的浓度。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤H还可以是Nile Red法检测样品血清FPLC各组分中甘油三酯。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤A中分离柱的定性的步骤是：

1)将Gel Filtration Calibration Kits中6种标准品按说明书配置成一定浓度：Ovalbumin 4mg/ml，Conalbumin 3mg/ml，Aldolase 4mg/ml，Ferritin 1.2mg/ml，Thyroglobulin 5mg/ml，Blue Dextran 2000 1mg/ml；

2)取各样品800微升，10000g离心10分钟，0.22微米滤膜过滤，过滤后样品收集至1毫升注射器中(200微升/支，每个样品3支)，用于上样；

3)标准品FPLC分离

(a)分离条件：进样体积：100微升；流速：0.3ml/min；信号采集波长：280纳米；

(b)分离：用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将样品进入上样环中，进样，0.3ml/min洗脱；

(c)统计：统计Blue Dextran 2000和其它5种蛋白保留体积，计算平均值。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤B中脂蛋白标准品保留体积的确定的步骤是：

1)取已知浓度的VLDL(0.60mg/ml)、LDL(1.55mg/ml)、HDL(2.01mg/ml)各800微升，10000g离心10分钟，0.22微米滤膜过滤，过滤后样品收集至1毫升注射器中(200微升/支，每个样品3支)，用于上样；

2)标准品FPLC分离

(a)分离条件：进样体积：100微升；流速：0.3ml/min；信号采集波长：280纳米；

(b)分离：用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将样品进入上样环中，进样，0.3ml/min洗脱；

(c)统计：统计三种蛋白保留体积，计算平均值。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤D中血清脂蛋白快速分离的条件为

(a)分离条件：进样体积：100微升；流速：0.3ml/min；接样体积：0.5ml，信号采集波长：280纳米；

(b)分离：用洗脱液对系统进行平衡(3个柱体积)，将血清样品进入上样环中，进样，0.3ml/min洗脱，洗脱至4ml时开始收集样品，0.5ml/管；

(c)统计：通过对各峰面积进行积分统计。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤F中血清脂蛋白亚组分的收集条件为：FPLC洗脱至4ml时开始收集样品，0.5ml/管，将洗脱组分转移至0.5mlEP管中，根据FPLC谱图中各洗脱部分序号对贮存管进行编号，4度保存，以备后续检测之用。