[发明专利]调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物

说明书

本申请是申请日为2006年4月14日、发明名称为“调节细菌的粘附和应激耐受力的方法和组合物”、申请号为200680021504.5的申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及细菌，特别是益生菌和乳酸菌，以及用于控制其中的细胞信号传导的方法和构建体。

发明背景

在小肠中，乳酸杆菌代表共生微生物区系的主要和重要组分。各种乳酸杆菌(Lactobacillus)种类已用作益生菌培养物，基于需要来自那种生物的特定利益和制造商所需的生物工艺特征，选择用于在食物或饮食辅助物中使用。所有益生菌培养物并不显示相同的特征，使得选择这些菌株和澄清其利益是极为重要的。乳酸菌且特别是乳酸杆菌是为了一系列预期的健康促进因素包括在食品中的常见种类。

乳酸菌(LAB)在各种环境小生境中天然发现，在所述小生境中它们作为复杂的微生物群落的成员存在。在每种小生境中的存活取决于该生物对各种条件的感觉和应答能力，所述条件例如温度、pH、营养物可用性、和细胞群体密度。LAB经常占据的一种主要小生境是哺乳动物的胃肠道(GIT)。多重信号转导途径可能控制粘着因子、应激应答基因和其他遗传决定子的表达，它们促进LAB在GIT的各种区室内的存活和竞争。某些肠乳酸杆菌连同革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌一起具有与肠上皮和其中的粘膜层结合的能力。这种结合被认为对于实现某些益生特性是重要的，所述益生特性包括竞争排斥、免疫调节、和递送生物治疗药物。尽管这种结合中涉及的分子机制仍未明了，但显然该过程是复杂的，涉及宿主-特异性、细菌-特异性、和环境因素。

某些肠乳酸杆菌连同革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌一起具有与肠上皮和其中的粘膜层结合的能力。定居这些表面的能力可以使益生菌获得超过其他固有和病原性微生物区系的显著优点。特别感兴趣的是这些细菌借以存活且潜在定居肠道的动态环境的机制。影响粘附的某些环境因素已得到研究，所述环境因素包括pH、生长期、和其他微生物的存在。

乳酸杆菌必须维持满足其自身生长需求以及经受得住不利条件之间的平衡，所述不利条件包括胃酸冲击、被宿主防御呈递和竞争微生物区系(Tannock(2005)Appl.Environ.Microbiol.71：8419-8425)。然而，关于这些应激物如何影响乳酸杆菌与肠环境中的各种基质结合的能力知之甚少。

发明简述

提供了改善细菌与靶基质的粘附和/或改善细菌的应激耐受力(stress tolerance)的方法和组合物。方法包括使细菌暴露于粘附适应性条件(adhesion adaptive condition)且从而增加细菌的粘附活性和/或应激耐受力。进一步提供的是具有被调节水平的自诱导物-2(AI-2)的细菌。组合物包括表达参与自诱导物-2生产途径的核酸分子的重组细菌。进一步提供的是自诱导物-2相关的融合蛋白、抗原肽、抗体和载体。进一步提供了筛选将刺激自诱导物-2生产和/或产生粘附适应性应答的化合物或环境条件的方法，以及使用具有增加的粘附和/或应激耐受力的细菌的各种方法。

本发明在本文的附图和下文所述说明书中进一步详细说明。

附图简述

图1表示如显微镜观察到的，嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)NCFM在体外与Caco-2细胞的粘附。细菌细胞(a)在未浓缩的条件(1x10⁸CFU/ml)下于37℃孵育1小时，或(b)形成团块且在10X浓缩的条件(1x10⁹CFU/ml)(AAR条件)下于37℃孵育1小时。

图2描述了粘附方案。

图3表示在标准孵育条件(实心棒)和粘附适应性条件(条纹棒)下，突变株和NCFM：：lacL对照菌株对Caco-2细胞的粘附特性。计数表示为平均细菌粘附/显微镜视野，且误差棒表示相对于平均值的1个标准差。

图4显示在嗜酸乳杆菌NCFM中由甲硫氨酸生产AI-2的途径。对于AI-2生产必需的中间产物以粗体表示，且编码每种酶的ORF在酶名称下列出。SAM-依赖性甲基转移酶缩写为SAM-MT。最后步骤涉及4，5-二羟基-2，3-戊二酮非酶促环化成AI-2。

图5显示与NCFM：：lacL对照菌株比较，嗜酸乳杆菌NCFM的LuxS^-突变株与Caco-2细胞的粘附能力。