[发明专利]一种用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用油厂土壤中筛选的菌株固态发酵生产脂肪酶的方法。

背景技术：

脂肪酶(1ipase，EC3.1.1.3)，又称甘油酯水解酶，可作用于脂肪分子中的羧酸酯键，催化脂肪水解为脂肪酸和二酰甘油、单酰甘油或甘油，也可催化甘油酯及水不溶性酯类的醇解、酯化、酯交换以及合成等反应。催化反应不需要辅酶，且反应条件温和、副产物少，反应通常具有高度立体异构专一性和化学选择性。

脂肪酶广泛存在于自然界中，是最早被研究的酶类之一。20世纪初国外的研究人员首次发现了微生物脂肪酶，由于微生物资源丰富，同时微生物脂肪酶相对于动物、植物脂肪酶而言，具有种类繁多、反应条件和底物的专一性类型广泛、便于进行工业化生产、容易获得高纯度的酶制剂以及制取成本较低等优点，因而微生物脂肪酶研究受到各国研究人员的广泛关注，并极大的带动了其在基础和实际应用方面的的研究。

由于国内产脂肪酶的方法大多还是液态产脂肪酶，固态发酵产脂肪酶的报道较少，因此，用筛选得到的产脂肪酶菌株固态发酵生产脂肪酶，不仅可作为今后生产和工业化生产上的出发菌株，而且也为脂肪酶基因的克隆、工程菌的构建奠定基础。

发明内容

本发明是为了解决菌种在固态发酵条件下产脂肪酶的问题，而采用在油厂附近土壤里提取出的菌株固态发酵产脂肪酶。用油厂附近的土壤来提取菌株固态发酵生产脂肪酶的方法通过以下步骤实现：一、将从大庆油厂附近的土壤，取2g土样与9ml无菌水混合，加玻璃珠振荡摇匀后静置片刻，取5ml上清液加入到富集培养基中，28℃～31℃，160r/min～190r/min振荡培养2d～5d。取10ml培养液加到另一新鲜富集培养基中继续振荡培养，重复此操作两次后，涂布在含有溴甲酚紫的固态脂肪酶筛选平板上。29℃倒置培养4d～5d，可观察到菌落周围形成黄色变色圈，表明该菌株可产脂肪酶。并筛选生长状况良好的菌株5株；二、将初筛到的5株菌株纯化后的斜面菌株接种至脂肪酶液体种子培养基培养3d，按0.3％的接种量将液体菌种接入液体产酶培养基中，将三角瓶置于28℃～31℃培养箱中振荡培养，结果测得发酵液中xjA的脂肪酶活力最高，为3.1U/ml；将xjA转接到发酵培养基中发酵培养2d～5d，再将菌株以同样的接种量(0.3％)转接到固态发酵产酶培养基中，发酵培养。当种龄为36h时脂肪酶活力最高为1450U/g，确定产酶量最高的菌株为xjA；三、把筛选得到产酶量最高的菌株xjA进行固态发酵培养，在种龄为36h，以0.3％接种量，在碳源和氮源为麸皮和豆粕的培养基上，分别考查了当碳氮比为0∶5，1∶4，2∶3，3∶2，4∶1，5∶0，培养基含水量为1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2，1∶2.5(培养基∶水)，发酵温度为25℃～33℃，发酵时间为1d～8d时发酵产脂肪酶的活力，确定了产脂肪酶的最佳固态发酵条件；四、在最佳碳氮比、培养基含水量、发酵温度和发酵时间的条件下接入xjA菌株，固体发酵产脂肪酶，对此时生产出的脂肪酶检测其活力，并测定此时发酵产出的脂肪酶活力为1450U/g。

在采用固态发酵法产脂肪酶的方法中，由于水分活度低，基质水不溶性高，微生物易生长，酶活力高，而且固态基质中气、液、固三相并存的优势，因此，本文筛选的脂肪酶菌株可作为今后生产和工业化生产上的出发菌株，为脂肪酶基因的克隆、工程菌的构建奠定基础。

具体实施方式