[发明专利]一种荧光检测植物木聚糖分布的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及用荧光检测植物木聚糖分布的方法。

背景技术

木聚糖(xylan)是一种以β-D-1，4木糖苷键形成主链的多聚五碳糖，常带有阿魏糖，阿拉伯糖等侧链。是主要的半纤维素成分，广泛分布在植物细胞中，是一种丰富的生物质资源，约占植物细胞干重的35％。木聚糖可以作为饲料，食品添加剂和生物质能源的原料。因此检测木聚糖在植物中的分布与含量，已经成为木聚糖研究的重要指标。

现有检测木聚糖分布的方法中，通常采用免疫荧光法和底物染料法。底物染料法是以木聚糖为基质，用交联方式连接和包裹特定的染料做成切片。底物染料法因为染料易溶于水而流失，导致染色结果可重复性差，而且染料颗粒大，不适合高精度观测。免疫荧光法是近年发展起来的一种新型检测技术，先用重组木聚糖结合蛋白与植物切片中木聚糖集合，再用抗组氨酸标记的抗体与重组蛋白中的组氨酸标记结合，最后与带荧光集团的第二抗体结合，从而标记出木聚糖的位置，在荧光显微镜下观察植物切片中木聚糖的分布。该方法中使用的抗组氨酸标记的抗体常会出现效价不高，特异性不强而使得木聚糖荧光信号弱，背景荧光信号过强，干扰检测结果。另外，抗体孵育时间长，会对植物切片造成破损，木聚糖分布显示会不完整。抗体成本高，特别是带荧光标记的第二抗体，直接增加耗材成本。不同批次的抗体之间的差别也导致荧光结果可比较性低。

发明内容

有鉴于此，本发明的要解决的技术问题有两个方面，一个是克服现有技术的弊端，提供一种适用于植物木聚糖检测的方法，另一方面是，提供基于该方法在木聚糖检测试剂盒中的应用。

本发明采用以下的技术方案检测植物木聚糖的分布：

1)制备重组蛋白

将目的蛋白的质粒转入大肠杆菌中，加入IPTG诱导蛋白表达。离心收获细胞，超声波破碎细胞。之后过镍柱洗脱该重组蛋白。透析后，蛋白溶液制备完成。

2)制备植物切片

将植物材料用石蜡包埋成方块。用旋转切片机切成薄片，粘在载玻片上。用二甲苯脱蜡，经酒精溶液置换入水中。用盖玻片封好备用。

3)检测植物切片木聚糖的分布

用制备的重组蛋白溶液浸泡有植物切片的载玻片30min，冲洗3～4次，滤纸吸干后放置在倒置荧光显微镜下检测绿色荧光的分布，即为植物切片中的木聚糖分布。

在本发明的另一方面，提供了基于上述方法在木聚糖分布检测试剂盒中应用，所述木聚糖分布检测试剂盒至少包含重组蛋白溶液和使用说明书。

所述木聚糖分布检测试剂盒，还可以包含：木聚糖酶，阳性对照的植物切片，石蜡，二甲苯，无水乙醇等试剂。

由于采用上述的技术方案，本发明中的结合荧光定量的木聚糖分布检测方法，克服了以往检测方法的弊端：

(1)避免使用各种抗体，节省抗体成本和抗体保存费用，操作的相关耗材成本和操作时间；

(2)本方法避免抗体带来的结果重复性差，荧光信号不强，背景过强；

(3)本方法避免抗体孵育过程中对植物样品的损坏，使得切片结构更完整；

(4)本方法使用的木聚糖结合蛋白特异性强，不与植物材料中其他成分结合；

(5)本方法不受抗体量的限制，容易放大，容易实现高通量操作。

综上所述，本发明具有特异性强，荧光信号强，背景信号弱，操作简单，快捷，容易放大，消耗更少等特点。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。需要指出的是，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社2002[美]J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔著，黄培堂等译)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1)制备重组蛋白