[发明专利]家蚕Bmlp3基因启动子及其运用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及家蚕Bmlp3基因启动子及其运用。

背景技术

家蚕是重要的经济昆虫，曾为中华民族文化经济社会发展做出了极为重要的贡献。同时，其遗传背景清楚，遗传资源丰富，又是国际公认的鳞翅目模式昆虫。家蚕的重要性状之一就是末龄幼虫脂肪体具有高效合成蛋白质的能力，在五龄后期至化蛹这段时间内，蚕的脂肪体非常发达，约占体重的30%，基于这一特点，将其开发成新型生物反应器，可以利用转基因蚕生产更多种类的有用蛋白，拓宽家蚕的应用领域，提高家蚕的应用价值，推动我国蚕学与昆虫学科的长远发展。

自基于piggBac转座子为介导的家蚕转基因技术获得成功以来，这项技术已经运用于家蚕基因功能的研究以及将转基因家蚕作为“生物工厂”的探索，例如Ras基因功能的研究，丝心和丝胶蛋白基因启动子的鉴定等等，这些都为本研究的工作开展打下了良好的基础。

30K蛋白是家蚕末龄幼虫血液中的主要蛋白，lp3基因是其家族中成员之一，它的以下特征促使将其调控元件作为开发脂肪体生物反应器的启动子：①脂肪体特异表达：所有的30K蛋白基因都是在脂肪体中合成后分泌到血液中，脂肪体是其转录合成的场所；②强大的转录效率：目前鉴定的30K家族成员已达到10个之多，它们的表达水平差异很大，lp3是其中表达量最高的基因之一；③时期表达相对集中：lp3基因从五龄中后期到蛹期这段时间内转录合成，与脂肪体蛋白质含量最高的时期相吻合。这些特征为利用家蚕Bmlp3基因启动子在脂肪体表达外源蛋白提供了理论支持，而且在利用piggBac来源的转座子介导的家蚕转基因的研究报道中，有关利用家蚕30K蛋白基因启动子在脂肪体表达外源蛋白的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基因启动子，该启动子以家蚕的基因组为模板，通过设计的lp3启动子上下游引物来扩增得到的。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述家蚕Bmlp3基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

上述序列的获得步骤为：以家蚕品种P50五龄三天的基因组为模板进行PCR扩增，上游引物为：5′-ggaattccagtatagttacaacggctgcccc-3′，下游引物为：5′-cgggatcccgcgtcgagtcctgcaatatgt-3′,扩增条件为94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸80秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

本发明的目的之二在于提供家蚕Bmlp3基因启动子的运用，该运用为开发家蚕脂肪体外源蛋白表达的生物反应器提供了新思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的家蚕Bmlp3基因启动子在脂肪体中表达外源蛋白的运用。

进一步，所述家蚕Bmlp3基因启动子在脂肪体中表达红色荧光蛋白的运用。

本发明的目的之三在于提供一种重组载体，所述重组载体注射到家蚕早期胚胎后可导致脂肪体表达外源蛋白。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的家蚕Bmlp3基因启动子的重组载体，所述重组载体为Bmlp3-DsRed-SV40片段同基础载体pBac[3xP3-EGFPafm]连接而成的pBac[Bmlp3-DsRed-SV40,3xP3EGFP]显微注射载体。

本发明的目的之四在于提供一种显微注射载体的制备方法，该方法操作简单。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

用于家蚕脂肪体表达外源蛋白的显微注射载体的制备方法，具体包括以下步骤：

A、pMD19-Bmlp3的构建

如SEQ ID NO:1所示的家蚕Bmlp3基因启动子与载体pMD19-T simple进行TA克隆后得到的重组表达载体，即pMD19-Bmlp3；

B、pSL[Bmlp3-DsRed-SV40]的构建

分别用EcoR I和BamHⅠ双酶切pMD19-Bmlp3质粒，回收家蚕Bmlp3基因启动子与分别用EcoR I和BamHⅠ双酶切的pSL[MCS-DsRed-SV40]载体片段进行连接，构建成pSL[Bmlp3-DsRed-SV40]；

C、显微注射载体的制备