[发明专利]人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS一管多重荧光PCR检测方法及其引物、探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体是人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别的一管多重荧光定量PCR检测方法及其引物、探针和试剂盒。

背景技术

人冠状病毒(human coronavirus virus，HCOV)是单链正义RNA病毒，属冠状病毒科。病毒为多形态，略呈球形。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein)，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点；小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein)较小，与包膜结合的蛋白；膜糖蛋白(M，Membrane Protein)，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成。

冠状病毒是成人普通感冒的主要病原之一，在儿童可以引起上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道。冠状病毒感染的潜伏期一般为2至5天，平均为3天。典型的冠状病毒感染呈流涕、不适等感冒症状。不同型别病毒的致病力不同，引起的临床表现也不尽相同，OC43和229E是引起人类普通感冒的主要病原体，OC43株引起的症状一般比229E病毒严重。NL63感染病人通常出现较温和的症状，但在感染小儿可出现严重的下呼吸道症状，该病毒在特定人群中危害严重。HKU1表现为细支气管炎和肺炎，多伴有基础疾病，尤其是呼吸道和心血管系统疾病。SARS可引起肺炎，并且容易引发严重急性呼吸综合症。

鉴于人类冠状病毒所造成的严重呼吸道疾病，特别是儿童，这就需要医疗机构提供准确快速灵敏的检测方法，快速诊断治疗，以达到控制疾病防止其流行的目的。目前，冠状病毒的诊断方法主要有以下几种：(1)病毒的培养分离；(2)血清学检测特异的IgG及IgM；(3)RT-PCR方法及荧光定量PCR方法。前两种方法都是早期开发的经典方法，PCR方法是针对病原体核酸的检测方法，克服了前面两种方法中存在的周期长、灵敏度不高的问题，特别是荧光定量PCR方法的引进，解决了PCR方法容易产生假阳性的问题，使其得到了快速的发展，该方法具有高特异性、高灵敏度、周期短、操作简单、成本低等多种优点。如中国专利申请CN03142615公开的“一种SARS冠状病毒荧光分子信标PCR检测技术”，是在S A R S-C o v的表面刺突蛋白基因区域设计一对基因扩增引物，在上下游引物中间设计一条荧光分子信标探针。此技术采用逆转录P C R的方法检测靶基因片段，适用于定性、定量检测标本中的S A R S-C o v R N A。

但目前开发的冠状病毒分型试剂基本都为单重荧光定量PCR检测试剂，不能对人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别进行同时检测；如要同时检测，也需要分别在5管中进行，其操作繁琐、费时耗力。

发明内容

为了克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SAARS五种型别的一管多重荧光PCR检测方法，以改进目前现有方法，从而使检测达到灵敏、快速、准确、节约材料和试剂的目的。

本发明的人冠状病毒OC43、229E、NL63、HKU1和SARS五种型别一管多重荧光PCR检测方法包括样品核酸的制备和多重PCR扩增步骤，其中，多重PCR扩增步骤中采用了序列如下所示的引物(见序列表SEQ ID NO：1-10所示序列)：

CoVOC43-F：CGATGAGGCTATTCCGACTAGGT

CoVOC43-R：CCTTCCTGAGCCTTCAATATAGTAACC

CoV229E-F：CAGTCAAATGGGCTGATGCA

CoV229E-R：AAAGGGCTATAAAGAGAATAAGGTATTCT

CoVNL63-F：GACCAAAGCACTGAATAACATTTTCC

CoVNL63-R：ACCTAATAAGCCTCTTTCTCAACCC

CoVHKU1-F：CCTTGCGAATGAATGTGCT

CoVHKU1-R：TTGCATCACCACTGCTAGTACCAC

CoVSARS-F：GTTTATCACCCGCGAAGAAG

CoVSARS-R：TCTCTAGTTGCATGACAGCCCT