[发明专利]HIV-1辅助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表达方法

权利要求书

1.一种HIV-1辅助蛋白Vif-Fc融合蛋白的表达方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

（1）构建重组表达载体pPIC9K-Vif-Fc；

（2）转化和筛选表达Vif-Fc融合蛋白的重组毕赤酵母；

（3）表达Vif-Fc融合蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）依次包括以下步骤：

a）PCR扩增HIV-1 Vif基因；

b）将步骤a）得到的PCR产物与含有人IgG4 Fc片段基因的重组质粒pKS-Fc进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，并16 ℃过夜连接，获得pKS-Vif-Fc；

c）将所述pKS-Vif-Fc和pPIC9K进行EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，并16 ℃过夜连接，获得重组质粒pPIC9K-Vif-Fc。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤a）Vif基因PCR的引物序列如下：

引物1：5′-CCGGAATTCATGGAAAACAGATGGCAGGTG-3′；

引物2：5′-CGCGGATCCGTGTCCATTCATTGTAT-3′。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤a）中，以PNL432质粒为模板，所述Vif基因全长为579 bp。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的转化是指：将所述重组质粒pPIC9K-Vif-Fc酶切线性化、磷酸化处理后，纯化、回收；然后和毕赤酵母GS115感受态共置于冰上冷却后进行电击；经加入预冷的山梨醇后，涂布于MD平板，经孵育，克隆得到His阳性酵母转化子。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的筛选是指：将所述His阳性酵母转化子涂布浓度为0-4.0mg/ml的G418平板，筛选得到高G418抗性的阳性酵母转化子，提取基因组，PCR扩增其中的Aox 1基因，得到2200 bp和1800 bp两个条带，即筛选得到甲醇利用快型阳性酵母转化子。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶切线性化采用内切酶SalⅠ；所述回收是采用酚/氯仿抽提方法；所述电击的条件为：电压1500-1700V， 电阻400Ω，电容25uF，时间4-5.5ms。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）依次包括以下步骤：将所述甲醇利用快型阳性酵母转化子接菌于YPD中，摇菌；再接菌于BMGY中，摇菌过夜至对数期；然后在4℃下离心，去掉上清后，用BMMY重悬菌体进行诱导表达培养；收集上清得到所述Vif-Fc融合蛋白。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导表达培养中，每隔24 h加甲醇至终浓度至0.5%。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以小鼠抗HIV-1 Vif多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗，通过Western Blot鉴定所述Vif-Fc融合蛋白的表达。