[发明专利]检测人BK病毒核酸的引物与荧光探针及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一套检测人BK病毒核酸的引物和荧光探针，及其在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。

(二)背景技术

多瘤病毒属于乳多空病毒属。其中BK病毒(BKV)的原发感染主要在儿童期，可以无症状或仅有轻微的呼吸道症状。以后病毒停留在肾脏进入潜伏状态，但BKV具有高传播性、低致病性的特点。在肾移植病人，多瘤病毒的潜伏感染率较高。约10％～60％的健康肾移植患者有可能出现无症状的多瘤病毒复活，常常是间隙性的，且不影响肾功能。但如果病毒持续大量复制可以导致肾小管上皮细胞溶解、坏死，并出现基底膜的裸露，从而进入血液循环。病毒血症表明病毒处于极度活跃状态，有进一步导致移植物损害的危险。当病毒血症持续发展，BKV不断在靶细胞就可能导致BKV相关性肾病(BKVAN)。目前对BK病毒的检测多采用PCR方法，本专利则根据该BK病毒VP1基因序列设计荧光定量PCR引物和荧光探针，采用本套引物和MGB探针的TaqMan荧光定量PCR技术使得人们可以在利用PCR高灵敏性的情况下，对BK病毒进行实时精确定量检测，不仅解决了PCR的定量问题，而且还大大提高了病毒检测的特异性。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种可应用于TaqMan荧光定量PCR技术检测BK病毒核酸载量的引物和荧光探针，及其在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一套检测人BK病毒核酸的特异性扩增引物与荧光探针，

上游引物序列为：5’-CAAGAATTCCCCTCCCCAAT-3’；

下游引物序列为：5’-GTACAGTTACAGCCTCCCACATCA-3’；

荧光探针序列为：5’-FAM-TGAATGAGGACCTAACCTG-MGB-3’；

探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。

在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物量的多少，或将带标记的PCR产物以ELISA的方式进行检测，再由此推测起始模板的量，但这些方法实际上都属于半定量水平，因为即使PCR条件已最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定性仍会给结果分析带来影响，从而影响定量这一目的。随着实时荧光定量PCR技术的出现，人们可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。

本发明检测人BK病毒核酸的引物，使得病毒核酸载量的检测敏感性大大提高，另外由于荧光探针的应用，使得其特异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得检测者可以在极少的标本中获得足够的信息。

本发明还涉及所述的引物与荧光探针在制备人BK病毒核酸的荧光定量检测试剂盒中的应用。所述试剂盒主要包括特异性引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等。该试剂盒关键在于特异性引物和荧光探针的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择。

为达到定量检测的目的，所述试剂盒还可包括人BK病毒核酸标准品，所述标准品序列如下：CAAG AATTCCCCTC CCCAATTTAAATGAGGACCT AACCTGTGGA AATCTACTGA TGTGGGAGGCTGTAACTGTA C。检测时先以梯度浓度的标准品溶液在相同条件下进行检测，绘制标准曲线，根据待测样品CT值，对照标准曲线，即可获知样品中人BK病毒核酸拷贝数。

将所述试剂盒应用于人BK病毒核酸的检测时，具体检测方法如下：

(1)提取样品DNA；待测样品可以是患者尿液、血液等；

(2)荧光PCR扩增检测：取PCR缓冲液、DNA聚合酶、脱氧三磷酸核苷混合物、特异性扩增引物和荧光探针配成反应液，加入样品DNA为模板进行扩增反应，反应条件为：42℃逆转录30min；95℃预变性2min；95℃，5s变性，55℃复性与延伸40s，收集FAM荧光，共40个循环；

(3)结果分析：如果有HEX荧光积累，则表示样品中存在人BK病毒；如果没有荧光出现，则表示样品中不存在人BK病毒。定量检测时，则同时以梯度浓度的标准品在相同条件下进行荧光PCR扩增，根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样品DNA的拷贝浓度。