[发明专利]一种同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种同时驱除炭疽杆菌毒力大质粒pXO1和pXO2的方法。

背景技术

炭疽杆菌是一种杆状、能形成芽胞的革兰氏阳性杆菌，能够引起人畜的炭疽病，如果不及时治疗，死亡率极高。炭疽杆菌含有两个致病相关的毒力大质粒：pXO1(181.6kb)和pXO2(96.2kb)。质粒pXO1编码保护性抗原、致死因子和水肿因子等炭疽毒素蛋白及他们的调控基因。质粒pXO2编码参与荚膜形成和降解的基因。这两个质粒对于炭疽杆菌的致病性至关重要，丢失任何一个质粒都会导致炭疽菌的毒力极大的减低。因此对于炭疽杆菌毒力大质粒的研究一直是研究的热点。构建驱除毒力质粒的突变菌株对于研究质粒在炭疽杆菌致病中的作用及染色体的相关调控非常重要。

驱除细菌的大质粒可以使用驱除化学试剂、高温培养或紫外照射等方法。Sterne等在1937-1939年期间，用含50％动物血清的培养基上，于20％CO₂条件下培养，挑选粗糙型集落，选育出无荚膜之弱毒菌株(pXO2^-)，广泛用于世界各国制备兽用炭疽芽胞苗。我国杨叔雅、庄汉澜等人1953年，采用人工紫外线照射定向变异方法，选育出人用弱毒菌苗株A16R(其为pXO1⁺pXO2^-)，经检定证明安全性和免疫原性较好，1960年正式用于制备人用炭疽活菌苗。2004年王秉翔采用在42.5℃高温培养筛选出一株pXO1丢失的突变炭疽菌，该菌株完全丧失了形成芽胞的能力。2006年展德文等采用42℃高温培养法，驱除了炭疽杆菌人用减毒疫苗株A16R(pXO1⁺pXO2^-)中的大质粒pXO1，获得一株无质粒的炭疽菌A16RP(pXO1^-pXO2^-)，该菌株芽胞形成能力正常；2007年韩国的Sung-Ha Park等人，采用42℃高温培养法从炭疽杆菌H9401(pXO1⁺pXO2⁺)株中驱除了大质粒pXO1，获得了一株衍生菌H94O1(pXO1^-pXO2⁺)。这些驱除大质粒的方法中，毒力大质粒的丢失是随机的，在驱除一个目的质粒的时候，很可能同时驱除另一个质粒，因而必须经过大量的筛选过程，有时甚至得不到所需要的菌株，另外，在筛选的过程中可能导致宿主菌染色体的随机突变，这必将使后期实验结果的解释复杂化，因而需要建立一种用于炭疽杆菌毒力大质粒驱除的特异、安全和有效方法。

质粒不相容是指两个不同的但是相关的质粒不能稳定地在同一个细胞中遗传。这种不相容性主要是由于互相竞争相同的复制位点或分离位点，或者是由于复制起始的抑制。使用这个原理可以模拟自然机制使用一个小的、高拷贝的质粒来去除毒力大质粒。这种方法驱除质粒可以特异的构建质粒缺失菌株而避免了诱导突变的危险。在一些细菌中已经应用质粒不相容原理成功的驱除了目的质粒，证明这是一种高效、安全的方法。但是由于对炭疽杆菌大质粒的复制和分离的还不是很清楚，因而该方法在炭疽杆菌中的应用尚未见报道。

一直以来，人们作了很多努力来解释pXO1的复制和分离，但是鉴定质粒pXO1的复制子的研究进展很慢，这是因为这个质粒不编码任何与其它质粒编码的已知的复制起始蛋白有相似性的蛋白。Robertson等人于1990年尝试这定位pXO1的复制起始区，克隆了pXO1的DNA片段进入大肠杆菌的质粒然后转化到枯草杆菌中，鉴定到了几个克隆，定位在质粒pXO1上一个11kb的区域，这段序列包含10个开放阅读框，编码的产物与已知参与theta复制的rep蛋白无序列相似性。1999年，Jacques Ravel等人用鸟枪法获得了pXO1质粒的全序列，pXO1质粒不含有已知的革兰氏阳性菌复制和分离相关的序列及复制蛋白。在2009年，Andrei P等人应用Cre-loxP重组系统鉴定到一个不同于以前鉴定到的pXO1复制起始区，这段序列长约5.95kb。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的一种DNA分子，为如下(1)或(2)或(3)

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；