[发明专利]提取莲细胞核DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域中提取DNA的方法，尤其涉及一种提取莲细胞核DNA的方法；具体涉及了一种以莲黄化苗叶片为材料、有效提取高质量莲细胞核DNA的方法。

背景技术

莲，俗称荷花，是被子植物中起源最早的植物之一，素有“活化石”之称。它在我国的栽培历史悠久，是重要的水生经济作物，集食用、药用、观赏于一身。因莲具有独特的经济、文化和观赏价值，已引起了人们广泛的重视，但就分子生物技术在莲研究中的应用，目前主要集中在品种鉴定及演化关系分析、种质间遗传多样性评估等方面，还未开展深层次的莲基因组学研究。

随着Illumina公司发布了新一代测序仪Genome Analyzer(Solexa产品系列)之后，Genome Analyzer作为新一代测序技术平台，具有通量高、单位成本低、测序周期短和操作简单等优点，是植物全基因组测序最经济有效的测序平台；但其对DNA质量有比较高的要求。DNA质量是基因组测序技术的基础，分离纯度高(少多糖、少多酚、少色素和蛋白质)、叶绿体DNA和线粒体DNA含量低的核DNA，是测序仪高效和准确工作的基础，也是使测序序列达到最高可用性的保证。

CTAB(十六烷基三甲基溴化铵法)法是一种快速简便的提取植物总DNA的常规方法(包括磨样、裂解、萃取、沉淀DNA，去除RNA等过程)，但通过CTAB法所获得的莲DNA样品含有较多的叶绿体DNA和线粒体DNA，而且杂质多、纯度低，在很大程度上影响莲基因组测序的均一性、无偏性和序列的有用性，从而最终影响序列的拼接质量，不适合用于莲基因组测序。因此，需要一种新方法提取高质量的莲细胞核DNA用于基于新一代测序技术的莲基因组测序。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的问题和不足，提供一种提取莲细胞核DNA的方法。

本发明的目的是这样实现的：

一、提取莲细胞核DNA的方法

本方法包括下列步骤：

①称取20克黑暗条件下培养的剔除叶柄的莲黄化苗叶片，放置到经-20℃预冷5-6小时的研钵中，再倒入适量的液氮，经快速研磨后得到细粉状样品；

②将细粉状样品转移至装有200毫升、经4℃预冷1-2小时的细胞核提取缓冲液Solution I的烧杯中，并在冰上用磁力搅拌器搅拌20分钟，得搅拌混合液；

③将搅拌混合液用两层纱布和两层Miracloth滤布(美国Caibiochem公司产品)过滤后，收集滤液，并转至50毫升离心管中，置于冷冻离心机上在4℃、1800rpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；

④向白色沉淀物中加入40毫升Solution I缓冲液，轻轻晃动使之混合均匀，置于冷冻离心机上在4℃、1800rpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液状，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；

重复步骤④两次，得到的白色沉淀物，即为纯化的细胞核；

⑤向纯化细胞核内加入5毫升65℃的细胞核裂解缓冲液Solution II，并加入10微升、浓度为10mg/ml的核糖核酸酶(RNase)溶液，轻轻转动使之混合均匀，在65℃的水浴锅中放置30分钟，期间上下颠倒混合一次，得混合液；

⑥向混合液中加入5毫升的氯仿：异戊醇＝体积比为24∶1的萃取液，上下颠倒混匀，然后在室温下静置5分钟，再于离心机上12000rpm离心15分钟，离心管内溶液上下分层，上层为水相，下层为有机相；

⑦吸取上层水相至另一50毫升离心管中，并加入4毫升的异丙醇，轻轻摇动混匀，再置于-20℃的冰柜中30分钟，沉淀出絮状的莲细胞核DNA；

⑧用牙签挑出絮状的DNA沉淀物至另一容量为2毫升的离心管中，加入1毫升70％乙醇洗涤液，轻轻摇动以充分洗涤DNA沉淀物，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液；

⑨再次加入1毫升70％乙醇洗涤液，对DNA沉淀物进行洗涤，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液，将离心管放置于超净工作台上3-4小时，以吹干离心管内残留的乙醇洗涤液，并干燥DNA沉淀物；

⑩向离心管中加200微升的Tris-EDTA(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，轻轻摇动至DNA沉淀物充分溶解，然后将离心管放入-20℃冰柜中保存。

工作原理：