[发明专利]表达猪肺炎支原体p65蛋白的减毒猪霍乱沙门氏菌的构建与应用

说明书

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪肺炎支原体膜蛋白p65基因的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株及应用。

背景技术

沙门氏菌作为活疫苗载体能够携带多种细菌、病毒或寄生虫的免疫原性基因，从而成为沙门氏菌病和其它疾病的多价重组基因工程活疫苗。近几十年来，以减毒沙门氏菌作为活疫苗表达载体的研究受到广泛的关注。其中，利用基因工程方法致弱的沙门氏菌作为活细菌载体来表达外源基因，已广泛应用于肿瘤、病毒病、细菌病以及寄生虫病等的疫苗研究。

沙门氏菌作为疫苗载体已经受到医学与兽医学的广泛重视。其主要优点是沙门氏菌可采用口服或滴鼻等粘膜途径进行免疫，操作方便，对接种对象的刺激小，同时能够将质粒DNA特异性地传递入巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞，从而有效激发相应的体液与细胞免疫应答^[1]。此外，沙门氏菌为胞内寄生菌，其在激发抗沙门氏菌免疫反应的同时，诱导产生针对外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应，并同时诱导粘膜免疫与全身免疫。因此，减毒沙门氏菌既可以作为针对同源抗原的活疫苗，也可以作为诱导针对其他病原微生物产生保护性反应DNA疫苗的载体^[2]。鉴于此，以减毒沙门氏菌作为粘膜免疫用的基因工程活疫苗表达载体具有无可比拟的优越性。另外，沙门氏菌载体本身具有免疫佐剂的作用^[3]，其LPS作为一种内在佐剂，可以刺激宿主细胞释放各种细胞因子。

减毒沙门氏菌保留侵袭力，可穿过粘膜组织，侵入粘膜局部相关淋巴结和脾、肝、肾等处的淋巴组织，并在侵入部位表达外源抗原，从而不仅局部粘膜产生SIgA，也激发全身性的体液和细胞免疫。以减毒沙门氏菌为载体进行粘膜免疫，是一种继传统的灭活与减毒疫苗后新的免疫方式，它能呈递多种抗原，在多处粘膜产生免疫作用，并引发全身性的体液和细胞免疫。与其它活疫苗载体相比，致弱沙门氏菌载体还具有培养简便、繁殖迅速、制备和使用方便、免疫原性强、经济等优点。重组胞内寄生菌经口服或注射免疫后，可通过细菌感染的方式将质粒DNA直接导入诸如巨噬细胞、树突状细胞等专职递呈细胞，被运送至相关粘膜和淋巴组织，诱导细胞免疫和体液免疫反应^[4]，同时获得对载体菌的免疫。减毒沙门氏菌经口服途径免疫小鼠，不仅安全、高效，而且可激发产生黏膜反应，对同源病原和异源病原均表现出良好的保护力^[5]。

猪霍乱沙门氏菌C500是在含醋酸铊的培养基中传500代后致弱的具有良好免疫原性的菌株，实践也证明C500株具有免疫原性好，能激活全身、局部和远端粘膜免疫系统的免疫作用，且有副作用低，安全性好的特点^[6]。其中，效果最稳定应用最多的是沙门氏菌Asd+平衡致死系统。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室徐引弟等构建C500株的asd基因缺失株ΔasdC500，经实验证实ΔasdC500缺失株进一步降低了C500的毒力，增强了疫苗的安全性。

猪支原体肺炎又称猪喘气病或猪地方流行性肺炎，分布十分广泛，以慢性、接触性、高度传染性、高发病率以及低死亡率等为特点，主要表现为咳嗽和呼吸困难，解剖可见肺组织呈肉变或者大理石样病变。

猪肺炎支原体是猪呼吸道疾病综合征的重要病原之一，可继发感染PRRSV、PCV2等，从而导致多种疫苗的接种失败。猪肺炎支原体可经空气传播，此外还易与其他细菌性疾病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发，对养猪业造成重大的经济损失，是当前最常发生、最广流行、最难净化的重要疫病之一。这主要是因为猪肺炎支原体能够穿透黏膜层与纤毛粘在一起，破坏纤毛的完整性，并分泌一些有害因子，从而改变纤毛的游走性，致使纤毛大量脱落，这为其它细菌和病毒的入侵创造了条件，致使损失加剧。