[发明专利]一种绿色木霉葡聚糖内切酶定位突变基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种绿色木霉葡聚糖内切酶基因以及其在生产纤维素内切酶方面的应用。

背景技术

纤维素资源是地球上最丰富的可再生资源，有效利用纤维素资源，可以缓解世界范围内日益突出的粮食和能源短缺问题。纤维素酶通过纤维素酶中三种组分：葡聚糖内切酶(endoglucanase，EG)，葡聚糖外切酶(cellubiohydralases，CBH)，以及β-葡聚糖苷酶(β-glucosidases，BG)的协同作用将纤维素水解为葡萄糖。其中内切葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分，它首先作用于纤维素，随机水解纤维素分子内部的糖苷键，将纤维素链打断，它对整个纤维素的降解过程中起关键的作用。

绿色木霉是产纤维素酶活性最高的菌株之一，它在自然界分布广泛，常腐生于木材、种子及植物残体上。目前已经克隆出多种内切葡聚糖酶基因，并在大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母中得到表达。前人的研究集中于在不同的微生物中克隆纤维素酶基因，优化重组酵母菌的培养条件等，并未将克隆到的基因进行改造，提高纤维素酶活力。中国发明专利201010173947.4公开了一种绿色木霉内切葡聚糖基因egVII及其编码的氨基酸序列，未对基因进行改造，未体现酶活优势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿色木霉葡聚糖内切酶基因，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

本发明的第二个目的在于提供一种绿色木霉葡聚糖内切酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的第三个目的在于提供一种含有绿色木霉葡聚糖内切酶基因的表达载体，优选为毕赤酵母分泌型表达载体。

本发明的第四个目的在于提供一种绿色木霉葡聚糖内切酶定位突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明的第五个目的在于提供一种绿色木霉葡聚糖内切酶定位突变基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的第六个目的在于提供一种含有绿色木霉葡聚糖内切酶定位突变基因的表达载体，优选为毕赤酵母分泌型表达载体。

本发明的技术路线为：

1)从腐朽的白杨树根中分离绿色木霉；

2)提取绿色木霉基因总RNA；

3)用总RNA进行逆转录反应，得到cDNA；

4)依据GenBank公布的已知葡聚糖内切酶基因序列设计特异引物，以绿色木霉逆转录cDNA作为模板进行PCR扩增，获得绿色木霉葡聚糖内切酶基因，命名为EG；

5)对绿色木霉葡聚糖内切酶基因进行定点突变，得到绿色木霉葡聚糖内切酶定位突变基因，命名为EG-mut；

6)将绿色木霉葡聚糖内切酶基因(EG)和绿色木霉葡聚糖内切酶定位突变基因(EG-mut)分别构建毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-EG和pPIC9K-EG-mut；

7)重组载体pPIC9K-EG和pPIC9K-EG-mut分别转化毕赤酵母，获得重组毕赤酵母，诱导表达重组毕赤酵母，并测定酶活，结果表明突变序列EG-mut的重组毕赤酵母菌株比原序列EG的重组毕赤酵母胞外分泌内切葡聚糖酶的酶活力提高了15.27％。

本申请从朽木中分离得到一株可分解纤维素的绿色木霉G-1，并从G-1中克隆到内切葡聚糖酶基因(EG)，对EG进行定点突变得到EG-mut，将两个基因分别插入分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9K，转化毕赤酵母后筛选得到分泌表达内切葡聚糖酶的重组毕赤酵母工程菌，突变序列EG-mut的重组毕赤酵母菌株比原序列EG的重组毕赤酵母胞外分泌内切葡聚糖酶的酶活力提高了15.27％；同时本申请涉及对发酵条件的选择和优化，可促进内切葡聚糖酶在工农业生产中的应用。

附图说明

图1是RT-PCR从绿色木霉中扩增EG基因琼脂糖凝胶电泳图；

图2A是EG和EG-mut的碱基序列对比图；

图2B是EG和EG-mut的氨基酸序列对比图；

图2C是EG基因的定点突变PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图；

图3是重组质粒的酶切检测琼脂糖凝胶电泳图，M：Marker；1：pPIC9K-EG重组质粒Bgl II单酶切；2：pPIC9K-EG-mut重组质粒Bgl II单酶切；

图4是重组毕赤酵母表达产物刚果红染色产生的水解圈，1：pPIC9K-EG-7；2：pPIC9K-EG-mut-10；3：pPIC9K；