[发明专利]表达猪肺炎支原体p46蛋白的重组猪霍乱沙门氏菌及制备方法与应用有效
申请号: | 201110087938.8 | 申请日: | 2011-04-08 |
公开(公告)号: | CN102732473B | 公开(公告)日: | 2017-03-15 |
发明(设计)人: | 何启盖;马丰英;邹浩勇;陈焕春;郭爱珍;徐高原;吴斌;张灏 | 申请(专利权)人: | 华中农业大学;武汉科前动物生物制品有限责任公司 |
主分类号: | C12N1/21 | 分类号: | C12N1/21;C12R1/42;C12R1/35 |
代理公司: | 武汉宇晨专利事务所42001 | 代理人: | 王敏峰 |
地址: | 430070 湖*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 表达 肺炎 支原体 p46 蛋白 重组 猪霍乱 沙门氏菌 制备 方法 应用 | ||
1.一株表达猪肺炎支原体主要免疫原性膜蛋白-p46蛋白的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)C500(pYA-46),保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),其保藏编号为CCTCC NO:M2011106。
2.一种重组的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-46)的制备方法,它包括下列步骤:
1)构建重组质粒pGEX-46:用一对引物扩增猪肺炎支原体膜蛋白p46的基因片断,并将其亚克隆至原核表达载体pGEX-KG上,构建重组质粒pGEX-46;所用引物对的核苷酸序列如下所示:
正向引物:CCCGGATCCATGAAAAAAATGCTTA(5′→3′),
反向引物:CCCAAGCTTTTAGGCATCAGGATTA(5′→3′);
2)利用三对引物将猪肺炎支原体的p46蛋白基因片断210bp、303bp和662bp处的碱基A人工定点突变为碱基G,所用引物的核苷酸序列如下所示:
正向引物:AATCCTCGATGGATTAGTGCC(5′→3′),
反向引物:CCATCGAGGATTATCCGGAT(5′→3′);
正向引物:CAAAATAACTGGCTCACTCAG(5′→3′),
反向引物:CCAGTTATTTTGTGCATCCTG(5′→3′);
正向引物:TCCCAGGATGGAATTATGGAA(5′→3′),
反向引物:CCATCCTGGGACATAAACAGC(5′→3′);
3)构建重组质粒pYA-46:以上述突变正确的重组质粒pGEX-46为模板,用一对引物进行PCR扩增,酶切后连接质粒pYA3493,转化x7213筛选阳性克隆,将阳性质粒电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株,得到保藏编号为CCTCC NO:M2011106的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-46);所用引物对的核苷酸序列如下所示:
正向引物:AAAGTCGACCATGAAAAAAATG(5′→3′),
反向引物:AATAAGCTTTTAGGCATCAGGAT(5′→3′)。
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