[发明专利]表达猪肺炎支原体p46蛋白的重组猪霍乱沙门氏菌及制备方法与应用有效

专利信息
申请号: 201110087938.8 申请日: 2011-04-08
公开(公告)号: CN102732473B 公开(公告)日: 2017-03-15
发明(设计)人: 何启盖;马丰英;邹浩勇;陈焕春;郭爱珍;徐高原;吴斌;张灏 申请(专利权)人: 华中农业大学;武汉科前动物生物制品有限责任公司
主分类号: C12N1/21 分类号: C12N1/21;C12R1/42;C12R1/35
代理公司: 武汉宇晨专利事务所42001 代理人: 王敏峰
地址: 430070 湖*** 国省代码: 湖北;42
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摘要:
搜索关键词: 表达 肺炎 支原体 p46 蛋白 重组 猪霍乱 沙门氏菌 制备 方法 应用
【权利要求书】:

1.一株表达猪肺炎支原体主要免疫原性膜蛋白-p46蛋白的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)C500(pYA-46),保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),其保藏编号为CCTCC NO:M2011106。

2.一种重组的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-46)的制备方法,它包括下列步骤:

1)构建重组质粒pGEX-46:用一对引物扩增猪肺炎支原体膜蛋白p46的基因片断,并将其亚克隆至原核表达载体pGEX-KG上,构建重组质粒pGEX-46;所用引物对的核苷酸序列如下所示:

正向引物:CCCGGATCCATGAAAAAAATGCTTA(5′→3′),

反向引物:CCCAAGCTTTTAGGCATCAGGATTA(5′→3′);

2)利用三对引物将猪肺炎支原体的p46蛋白基因片断210bp、303bp和662bp处的碱基A人工定点突变为碱基G,所用引物的核苷酸序列如下所示:

正向引物:AATCCTCGATGGATTAGTGCC(5′→3′),

反向引物:CCATCGAGGATTATCCGGAT(5′→3′);

正向引物:CAAAATAACTGGCTCACTCAG(5′→3′),

反向引物:CCAGTTATTTTGTGCATCCTG(5′→3′);

正向引物:TCCCAGGATGGAATTATGGAA(5′→3′),

反向引物:CCATCCTGGGACATAAACAGC(5′→3′);

3)构建重组质粒pYA-46:以上述突变正确的重组质粒pGEX-46为模板,用一对引物进行PCR扩增,酶切后连接质粒pYA3493,转化x7213筛选阳性克隆,将阳性质粒电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株,得到保藏编号为CCTCC NO:M2011106的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-46);所用引物对的核苷酸序列如下所示:

正向引物:AAAGTCGACCATGAAAAAAATG(5′→3′),

反向引物:AATAAGCTTTTAGGCATCAGGAT(5′→3′)。

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