[发明专利]一种利用甘蓝游离小孢子不定芽叶片再生DH植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术和植物育种技术领域，涉及利用一种植物单倍体育种方法创制足够数量纯合育种自交系资源，尤其是一种利用甘蓝游离小孢子不定芽叶片再生DH植株的方法。

背景技术

甘蓝(Brassica oleracea L.)原产于地中海沿岸，为十字花科芸薹属二年生异花授粉作物，春化需要植株生长到一定体积大小，才能感应低温，通过春化，属绿体春化型，其具有十分明显的杂种优势。甘蓝一代杂种在国内外已被普遍应用，其优良一代杂交种的育种研究是以丰富优良、遗传性稳定的纯合自交系为基础的。目前，国内外甘蓝优良自交系选育主要采用两条途径，一条是通过常规育种靠多代连续自交定向选择获得，一条是通过单倍体育种采用游离小孢子培养技术获得稳定双单倍体纯合系(DoubleHaploid简称DH株系)；前者常规育种方法，自交系纯合选育周期较长，一般需要6～8年，后者单倍体生物技术育种，它是一种快速纯合自交系和创制新育种资源的有效育种途径，创制自交系周期较短，仅需2～3年，育种效率显著，但技术难度较大。甘蓝游离小孢子培养中除普遍存在小孢子发育的同步性较差，成胚率远低于其他芸薹属作物，即使诱导成胚，一个小孢子胚状体仅能再生同一基因型1～2个DH植株，即使胚状体不定芽再经2～3次继代后也只能得到同一来源小孢子胚状体4～6个DH株，不利DH植株群体农艺性状提早鉴定、也延迟了育种年限，这些问题不仅影响着甘蓝游离小孢子培养技术有效应用，而且也阻碍着甘蓝杂种一代新品种的快速选育。因此，我们针对甘蓝植物学特性，为了提高甘蓝单倍体育种中游离小孢子培养技术应用效率，研究发明出一种利用甘蓝游离小孢子不定芽叶片再生DH植株的方法成为该领域的一个创新点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用甘蓝游离小孢子不定芽叶片再生DH植株的方法。采用如下技术方案：

一种利用甘蓝游离小孢子不定芽叶片再生DH植株的方法，包括以下步骤：

A1，胚状体不定芽诱导；A2，外植体获得：以小孢子胚状体诱导出不定芽叶片达1cm时起计算叶片生长日龄，选用一定生长日龄的叶片作为离体培养的外植体。在超净工作台上将培养有胚状体不定芽的试管外部消毒后，随后打开试管口从叶柄处剪下叶片，然后将叶片切成1.0cm见方的小方块；A3，外植体再生芽的分化诱导，将步骤A2获得的外植体接种于外植体再生芽分化培养基上进行离体培养，培养条件为：温度(25±1)℃，光照16h·d^-1，光强为2000lx的条件下诱导培养；A4，再生芽的生根诱导与移栽，剪下长有3～4片叶的再生芽插入MS+NAA 0.3mg·L^-1生根培养基进行生根；当DH株根系长至4～5cm左右时开始炼苗，三角瓶封口膜先半开半闭，2天后完全打开，7天后取出DH株小苗将根部残留培养基用流水洗净，移栽到装有专用培养土，即体积比为培养土∶珍珠岩∶蛭石＝2∶1∶1的培养钵中，同时将培养钵放至有少量水的穴盘之中并置于半阴处，加强浇水管理，1周后带基质移栽到大田中。

所述的方法，优选的，步骤A2中，所述的外植体叶片生长日龄为25天。

所述的方法，优选的，所述外植体再生芽分化培养基为：MS+6-BA 2.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+GA₃1.5mg·L^-1；蔗糖、琼脂浓度和pH值分别为30g·L^-1、8g·L^-1和5.8。

本发明选择合适生长日龄的甘蓝小孢子胚状体不定芽叶片为外植体来源，在所述分化培养基上快速诱导分化成再生芽，再经生根移栽，获得大量健壮的甘蓝DH植株。该方法具有弥补甘蓝游离小孢子培养中1个小孢子胚状体诱导出不定芽仅能再生出少量DH株的数量不足，在短时间内将有限的同一基因型的小孢子DH植株数量扩大32倍以上，从而在当年获得足够数量能够达到农艺性状鉴定标准的、确保通过绿体春化体积大小的同一基因型的小孢子DH群体，克服了甘蓝游离小孢子常规多次继代培养存在小孢子不定芽生长势减弱、继代成活率低、生长周期长、DH植株群体和体积均过小，不利性状选择和难以春化等诸多缺陷，实现了当年经济性状田间鉴定和次年花期配合力测定，达到比普通小孢子培养育种缩短1年时限，从而提高甘蓝育种效率。

附图说明

图1中A为小孢子子叶型胚状体；B为子叶型胚状体在分化培养基上诱导的不定芽

图2中A为外植体培养3天时的生长表现；B为外植体在所述培养基上诱导的再生芽；