[发明专利]基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。而纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素这一巨大可再生资源的有效利用对解决环境污染、食品短缺、能源危机具有重大现实意义，利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素则是纤维素利用的有效途径。但目前纤维素酶的高成本和低酶活，影响了纤维素酶的工业化生产和广泛应用。因此通过基因工程和蛋白质工程技术对内切葡聚糖酶进行改造具有重要的科学和实用价值。

芽孢杆菌能产生中性或偏碱性内切葡聚糖酶，它不同于以往绝大多数的真菌产生的酸性内切葡聚糖酶，能够应用于棉纺织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中，对其的研究是目前的热点。然而，自然界筛选出来的菌株都有酶活较低，且表达量不太稳定。

易错PCR技术是定向进化研究最早采用的一种构建基因文库的方法。首次提出易错PCR是Leung等人。易错PCR是指通过改变PCR的反应条件，如：调整反应体系中4种dNTP的浓度、增加Mg²⁺的浓度、加入Mn²⁺或使用低保真度Taq酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，构建突变库，筛选出所需的突变体。易错PCR的关键是控制DNA的突变频率。如果DNA的突变频率太高，产生的绝大多数酶将失去活性；如果突变频率太低，野生型的背景太高，样品的多样性则较少。对于每一DNA序列来说，合理的碱基突变数是1-3个。理想的碱基置换率和易错PCR的最佳条件则依赖于随机突变的目标DNA片段的片段长度。在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，所以属于无性进化。由于它较为费力、耗时，一般多用于较小基因片段(＜800bp)的改造。在通常情况下，经一轮的易错PCR、定向筛选，很难获得令人满意的结果，由此发展出了连续易错PCR(sequential error-prone PCR)，该方法是将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。

发明内容

本发明的目的是针对目前碱性内切葡聚糖酶酶活低、难以满足工业生产需要的缺点，对来源于枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因进行定向进化，筛选出酶活显著提高的突变体，为内切葡聚糖酶工业应用奠定基础。本发明的具体实施步骤如下：

1、获得突变内切葡聚糖酶基因

(1)接种一环含有pMD19-T-Cen质粒的大肠杆菌DH5α于10mL LB(Amp)液体培养基中37℃培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明提取pMD19-T-Cen质粒。提取的质粒通过Bgl II，Sph I双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错PCR的模板。

(2)调整反应参数和反应体系，通过引物

P1：5’-TAATCCAACCCGGAATTCGCAGAGACAAAAACGCCAGTAGC-3’

P2：5’TAGGAAAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAA-3’

进行易错PCR。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，使用纯化试剂盒对易错PCR产物进行纯化回收。

2、内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建

(1)将回收的易错PCR突变的内切葡聚糖酶基因库经EcoR I，NotI双酶切后，连入同样经过EcoR I，NotI双酶切的含有T7lac启动子和氨苄青霉素抗性基因的表达载体pET-32a(+)中。

(2)大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备方法为：将E.coli BL21划线接种LB平板，37℃培养直至长出单菌落；挑取一个单菌落，接种至含有10mL LB培养基的50mL三角瓶中，37℃，170rpm培养过夜；将上述培养液按1％接种量接种到50mL LB液体培养基中，37℃，170rpm振荡培养1.5-2小时；将培养后的菌液置冰浴中，使培养物冷却到0℃，10min后转移到无菌的50mL离心管中，4℃，4300rpm离心5min，倒掉上清液；向管中加入30mL无菌预冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶液重新悬浮菌体，4℃，4300rpm离心8min，去掉上清液；向管中加入2mL无菌预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重新悬浮菌体；