[发明专利]一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用。

背景技术

养殖业中，每年约有10％的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但药物防治常会产生不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株，易污染环境等问题，因此建立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。

目前弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏手册，通过对微生物的生理生化特征进行检测来进行鉴定的，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐；16SRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SRNA，手续较繁琐，且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴性，即使采用单克隆抗体，由于制备技术要求较高、周期较长，也使其应用受到限制。

指数富集配体进化技术（Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment），简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出了肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。

溶藻弧菌是一种广泛分布于世界各地海水及河口处的一种病原微生物，其数量居海水类弧菌之首，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部发炎等疾病，对公共卫生安全构成十分严重的威胁。因此，运用SELEX技术筛选溶藻弧菌适配子，并将其应用于溶藻弧菌的识别鉴定，能大大提高溶藻弧菌检测的灵敏度和特异性，成为本发明的重点。

发明内容

本发明的目的在于提供了一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用。本发明具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且制备容易，制备周期较短。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4四条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌识别检测。首先合成用于筛选的寡核苷酸文库（5′- TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC ---- N35 ---- GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG -3′），然后将该文库与溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选，筛选产物经克隆测序后，从中挑选出有代表性的适配子进行亲和力和特异性的验证，最终获得4条对溶藻弧菌有较好亲和特异性的寡核苷酸序列（适配子）。

一种可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的应用，所述的寡核苷酸序列具有识别检测溶藻弧菌的用途，且采用上述四条寡核苷酸序列中的任意一条就能够单独应用于溶藻弧菌的检测。

所述的四条寡核苷酸序列的5′端均标记有地高辛。

本发明的有益效果为：本发明具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且制备容易，制备周期较短。

附图说明

图1为本发明实施例1中5条序列（5个适配子）与溶藻弧菌的亲和力比较图；

图2为本发明实施例1中5条序列（5个适配子）与哈维式弧菌的亲和力比较图；

图3为本发明实施例1中5条序列（5个适配子）与嗜水气单胞菌的亲和力比较图；

图4为本发明实施例1中5条序列（5个适配子）与迟钝爱德华氏菌的亲和力比较图；

图5为本发明实施例1中SEQ ID No.1适配子对4种不同菌种的识别效果图；

图6为本发明SEQ ID No.2适配子对4种不同菌种的识别效果图；

图7为本发明SEQ ID No.3适配子对4种不同菌种的识别效果图；

图8为本发明SEQ ID No.4适配子对4种不同菌种的识别效果图。