[发明专利]柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体及其制备方法，以及该抗体在检测柑橘黄龙病菌中的应用。

背景技术

柑橘黄龙病是柑橘生产上防治难、危害重、威胁大的一种毁灭性病害，被人们称作柑橘上的“艾滋病”，广泛分布在我国几乎所有的柑橘产区。浙江省于上世纪80年代在温州南部首次发现该病害，随着气候变暖和柑橘生产的发展，疫情北扩，目前除衢州和杭州尚未有报道外，台州、温州等主要柑橘产区病情严重。作为一种毁灭性病害，柑橘染病植株往往在2～3年内丧失结果能力或死亡，甚至造成毁园。柑橘黄龙病的猖獗危害和蔓延扩散，对柑橘产业的稳定和发展造成了严重的威胁，已经成为柑橘产业发展的重大障碍。

目前对柑橘黄龙病尚缺乏有效的防治药剂和理想的抗性品种，因此综合防治是当前该病害防治的主要方法。其中，严格的植物检疫是保护无病区和新区柑橘的前提，建立无病毒苗圃、培育和种植无病毒苗木是预防黄龙病的基础，及时消灭传病木虱和彻底挖除病树是防止病害流行的关键措施。然而，这些工作的开展都必须建立在明确柑橘材料内是否存在黄龙病菌的基础之上。因此，对黄龙病菌快速准确地检测和诊断是当前该病害有效防控的重要前提。

现有对柑橘黄龙病的检测和诊断，已经发展了多种方法和技术，如田间诊断、指示植物鉴定、显微镜观察、血清学检测、核酸杂交检测及PCR检测等。虽然这些方法促进了人们对柑橘黄龙病的深入研究起一定的作用，然而在柑橘实际生产应用中却表现出不同程度的局限性。如在田间诊断过程中，由于病害症状复杂多变，且易与缺素、病毒病害和药害等症状相混淆，因此常导致诊断错误；而嫁接成功率不高和稳定性差等问题影响了通过指示植物进行鉴定的效率，且该方法耗时较长(往往要经过几个月时间才能得知鉴定结果)；通过显微镜、血清学等方法鉴定则需要特定的仪器设备和专业的实验技能；核酸杂交和各种PCR技术虽然可以快速准确地检测黄龙病，但与显微镜、血清学等方法一样，需要昂贵的仪器设备、试剂材料和熟练的实验技能。因此，迫切需要开发一种新技术或新产品，应用于柑橘实际生产中对黄龙病快速、准确地检测和诊断。

胶体金标记免疫层析技术是一种新型的免疫学快速检测和诊断技术。以此为基础开发的胶体金免疫层析试纸条不仅具有灵敏度高、特异性强、使用方便、检测快速(通常可在10分钟内得到检测结果)等特点，而且在使用过程中不需要特定的仪器设备和复杂的操作技巧，因此特别适应于广大基础单位和个人的现场检测和诊断。胶体金免疫层析试纸条主要工作原理是抗原与抗体的特异性结合，因此制备高质量的抗体是研制理想的检测产品的关键。通过以往对黄龙病的血清学研究发现，制备的黄龙病菌抗体往往只与相似的抗原发生结合，有时甚至只与制备该抗体的抗原结合。并且目前黄龙病菌仍不能人工培养，所以用于制备抗血清的抗原只能从大量的植物病叶中提取，但该病菌仅局限存在于韧皮部筛管细胞中，含量较低且分布不均匀，因而所抽提的病菌浓度和纯度较低，进而导致所制备的抗血清效价较低、特异性较差。这些问题在很大程度上限制了黄龙病菌抗血清及相关产品或技术的开发和应用。

通过原核细胞对蛋白进行高效表达是获取高产量、高纯度抗原的有效途径，革兰氏阴性细菌外膜蛋白(outer member protein，OMP)作为细菌外膜的重要组成部分，具有良好的免疫原性。目前已经获知黄龙病菌外膜蛋白基因序列，且分析发现其具有较强的表面抗原活性。但通过体外表达方式大量获得该蛋白，并以此为免疫原制备抗血清并将其用于柑橘黄龙病菌的检测并未有见报道。

发明内容

本发明的目的在于通过对柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因进行原核表达，获得了大量高纯度的目的蛋白，并以此为免疫原注射大白兔，制备并纯化了抗外膜蛋白的多克隆抗体，同时提供柑橘黄龙病菌外膜蛋白的多克隆抗体的制备方法，以及该抗体在检测柑橘黄龙病菌中的应用。

本发明柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体：其特征在于由原核表达获得的目的蛋白作为免疫原注射大白兔后制备获得，分别与柑橘黄龙病菌外膜蛋白N端和C端特异性结合，有效检测柑橘材料中存在的黄龙病菌。

本发明通过对柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因进行原核表达，获得了大量高纯度的目的蛋白，并以此为免疫原注射大白兔，制备并纯化了抗外膜蛋白的多克隆抗体。经效价测定和酶联免疫实验表明，所制备抗体效价高、特异性好，可用于田间感染柑橘黄龙病菌样品的检测。该产品为进一步开发可用于柑橘黄龙病菌现场快速检测的胶体金免疫层析试纸条奠定了基础。

本发明柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于：