[发明专利]马铃薯致病疫霉Δ6去饱和酶基因PinD6的克隆及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及在马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)超长链多不饱和脂肪酸合成代谢途径中Δ6去饱和酶基因PinD6的克隆、功能鉴定与应用，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

超长链多不饱和脂肪酸，一般含20-22个碳、4-6个顺式双键，例如花生四烯酸(AA，20:4Δ^{5，8，11，14})、EPA(20:5Δ^{8，11，14，17})以及DHA(22:6Δ^{4，7，10，13，16，19})对人类营养和健康具有重要的作用。经常补食EPA和DHA这类脂肪酸不仅对胎、婴幼儿大脑皮层及神经元的发育具有重要作用(Crawford，2000)，而且能够降低心脑血管疾病、高血压以及炎症等疾病的发病率(Thies et al.，2003；Kinsella et al.，1990；Yamazaki et al.，1992)。目前，这类脂肪酸主要来源于深海鱼油。由于过度捕捞，导致海洋野生鱼资源日益枯竭，鱼油产量已经不能够满足人们正迅速增长的需要(Pauly et al.，2003)。此外，由于环境污染等，导致鱼油中重金属离子与有机氯等有毒物质的含量升高，严重影响鱼油的食用安全性(Yokoo et al.，2003；Drexler et al.，2003)。因此，迫切需要一条持续、稳定、安全的鱼油替代生产途径。

高等植物能够大量合成亚油酸(LA，18:2Δ^9，12)和亚麻酸(ALA，18:3Δ^9，12，15)，但是不能够合成超长链多不饱和脂肪酸。一些真菌和微藻等能够将自身的LA和ALA通过“Δ6去饱和途径”中的一系列链延长酶和去饱和酶催化作用转化生成EPA和DHA。LA和ALA在Δ6去饱和酶的催化作用下，生成γ-亚麻酸(GLA，18:3Δ^6，9，12)和十八碳四烯酸(SDA，18:4Δ^{6，9，12，15})，然后再在Δ6链延长酶催化作用下生成二高-γ-亚麻酸(DGLA，20:3Δ^8，11，14)和二十碳四烯酸(ETA，20:4Δ^{8，11，14，17})。最后，在Δ5去饱和酶催化作用下生成AA和EPA。EPA经过一次Δ5链延长和一次Δ4去饱和生成DHA。

通过代谢基因工程技术将海洋微藻或真菌中的超长链多不饱和脂肪酸合成代谢途径移植到植物中，从而在植物特别是油料作物种子中生产此类脂肪酸，将是一条理想的鱼油替代生产途径。目前，此合成代谢途径中的相关基因已经陆续在高等植物、海藻、真菌、线虫、苔藓以及动物等克隆到(Yadav et al.，1993；Wallis and Browse，1999；Qi et al.，2002；Michaelson et al.，1998；Sayanova et al.，2006；Kajikawa et al.，2006；Choet al.，1999；Sperling et al.，2000；Leonard et al.，2000；Watts and Browse，1999)，并都已申请专利保护。尽快发掘克隆这类基因资源，获得具有自主知识产权的基因，为我国通过转基因技术在油料作物中生产此类保健脂肪酸奠定基础，是本项发明创造的重要目的。

(三)发明内容

本发明首先提取马铃薯致病疫霉总RNA，反转录成cDNA后，用引物5’-ATGGTGGACGGCCCCAAG-3’和5’-TTACATGGCGGGAAACTC-3’做PCR，将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体pMD18-T中。生物信息学分析，得到的cDNA片段开放阅读框部分为1371bp，编码456个氨基酸的多肽，具备“front-end”去饱和酶所具有的N端细胞色素b5结构域(HPGG)，以及和电子传递有关的三个组氨酸框结构域(HxxxH、HxxHH和LNxQxxHHLFP)。该基因cDNA序列如下：

序列表

(1)SEQ ID NO.1的信息

(a)序列特征

*长度：1371碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)

(f)序列描述：SEQ IN NO.1