[发明专利]一种含有转基因位点的番茄株系的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程中的植物转化技术领域，更具体涉及一种含有特定的转基因位点的番茄株系的制备方法。

背景技术

定点重组技术是在转基因研究中基于定点重组系统而开发出来的一种从基因组中删除序列或者将外源基因整合到基因组的特异性位点中去的新型技术。定点重组的基本原理分基因删除和基因整合两个方面来描述。共同点是它们都包括重组酶和一段能被该酶识别的DNA序列。对于基因删除，是在同一个DNA分子中含有两个同向的重复序列，这段序列可以被特异的重组酶识别，从而在这两段重组酶识别位点处发生DNA的融合交换，将这两段序列间的基因删除出去。对于基因整合，是在两个DNA分子中各含有一个重组酶识别位点，当重组酶介入时，这两段序列互相识别而将外源的基因带入到基因组中去。基因叠加技术则是基因整合的延伸，在外源DNA分子上除了含有与内源重组酶识别位点同源的序列之外，还含有一个新的重组酶识别位点，以便下一个基因整合时再次被识别，这样外源基因就可以逐一定点叠加到靶基因组中。基因叠加的示意图如图1所示(Ow，2005)。

植物中已被应用的定点重组系统有3种：大肠杆菌噬菌体P1的Cre/lox重组系统(Sauerand Henderson 1988)、酿酒酵母2μm质粒的FLP/frt重组系统(Golic and Lindquist 1989)和接合糖酵母的pSR1质粒的R/Rs重组系统(Onouchi et al.1991)。除了以上3种重组系统之外，还有两种不可逆的重组系统，一种是β-six和γδ-res重组系统，该重组系统具有相同的重组酶识别位点，但是只能催化DNA片段的删除，而不能催化DNA的整合。另一种是phiC31，TP901-1，λ，Bxb1等重组系统(Thomson and Ow 2006)，该重组系统最大的特点是识别两个不同的重组位点(attB和attP)，重组反应发生后由于碱基交换产生两个与原来不同的位点attL及attR；而重组酶不能继续催化新生成的位点间的反向重组反应。

利用随机插入和整合的转基因技术，筛选优良株系是非常烦琐的过程，而且费时费力，转基因技术的新突破在于通过高效定点重组反应介导外源基因在特定位点的逐一导入，并且能进行稳定表达和遗传，为多基因复合性状的转基因技术提供了理论依据。定点重组反应在特异性位点整合进目的基因的同时，在目的基因后端保留一个重组酶的识别位点，而基因叠加技术则利用该识别位点，将含有相应识别位点的第二个外源基因整合进去，植物体中的重组酶识别位点和外源载体中的重组酶识别位点在重组酶的作用下发生交换重组，依此类推，就可以达到在特定位点进行基因叠加的效果。而且每发生一次重组的同时，选择标记基因也被删除，因此进行第二次重组时，可以使用与前一次同样的选择标记基因，从而降低转基因技术中选择标记基因的负面影响。

特定位点的基因叠加技术可以多次利用同一插入位点，将多个优良性状累加到一个优良品种中，减少外源基因结构的不确定性，并保证外源基因的稳定表达，降低外源基因对基因组中其他基因的影响。同时，大大缩短了新品种的育种年限，加快转基因作物的研发进程。另外，特定位点的基因叠加技术是研究基因家族和同一代谢途径中多个基因功能的优良平台。通过将多个基因整合到同一插入位点，可以系统地比较每个基因的功能，并有效地研究基因间的拮抗和协同作用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种含有特定转基因位点的番茄株的制备方法，实验所用的番茄品系编号为HW0160(由北京蔬菜研究中心柴敏老师赠送)，无限花序，粉色大果。该株系中含有一系列可以被定点重组酶识别的位点，这些位点可用于后续基因的逐步叠加，使多个基因逐步叠加到靶基因株系中的同一个位点上并稳定表达。将含有重组酶识别位点的载体pYWP72，在农杆菌介导下侵染番茄子叶，获得转基因苗，再通过与野生型杂交，获得只含有一个转基因位点的番茄靶基因株系。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种含有特定转基因位点的番茄株的制备方法，其步骤是：

1、T₀代含有特定转基因位点的番茄转化苗的制备：通过农杆菌介导的子叶侵染法，将载体pYWP72(Yau et al.，2011)转化到番茄HW0160株系中，获得可能含有特定转基因位点的T₀代番茄转化苗33株。