[发明专利]一种可用于表达miR-122载体pSU6-miR-122的构建方法及用途

说明书

技术领域：

本发明涉及分子生物学、病毒学和基因治疗领域，更具体涉及一种可用于表达miR-122载体的构建方法,该载体在抑制乙型肝炎病毒的药物中的用途。

背景技术：

乙型肝炎病毒（HBV) 是嗜肝DNA病毒（Hepadnavirus)科中哺乳动物病毒属的一员。HBV具有一个3.2kb的部分双链的基因组，包括4个开放型的阅读框架，分别为编码核壳的C基因、编码聚合酶的P基因、编码外膜蛋白的S基因和调节病毒基因转录水平的X蛋白。乙型肝炎病毒（HBV）感染可以引起急性和慢性肝病变。每年全世界死于由于乙肝病毒感染而导致的肝硬化或肝癌的人数超过1百万人。每年被该病毒感染的人数达5万人。全世界范围内，大约有20亿人被乙肝病毒感染过，有3亿5千万人是乙肝病毒的长期带病者。而中国则有1亿2千万人是病毒的长期携带者（刘崇柏等（1997）中国公共卫生学，13：515）。病毒病的治疗是一世界难题，没有很好的药物或方法。抗病毒药物的治疗已有近30 年的历史,由于病毒进入机体后,在宿主细胞内进行复制和繁殖,因此,能抑制病毒繁殖的药物对宿主细胞或机体有不同程度的损害,使得抗病毒药的发展缓慢。到目前为止,尚无令人完全满意的抗病毒药。如抗乙肝药物α干扰素是目前公认的治疗慢性乙型肝炎的首选药物,但其疗效仅可使25 %～40 %的病例获得有效答；拉米夫定对HBV DNA 的抑制作用及治疗HBV 感染的短期疗效已得到肯定，但长期应用可诱导HBV 产生耐药性。而近年来发展起来的microRNA技术在抑制病毒复制上效率高，特异性强，没有毒副作用。因而microRNA在抗病毒治疗上显示了诱人的前景。

MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—25个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。研究发现miRNA的主要功能是调节生物体内在的与体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达，据推测这种小分子调节着人类三分之一的基因。最新的研究结果表明：MiR-122是一种在肝脏组织中特异性表达的MicroRNA与病毒的复制有关。

发明内容：

本发明的目的是在于提供了一种可用于表达miR-122载体的构建方法，方法易行，操作简便，该载体能抑制乙型肝炎病毒复制.相比于化学合成miR-122,用载体表达更经济、更稳定，使用更方便。

本发明的另一个目的是在于提供了一种表达miR-122载体在制备或预防乙型肝炎病毒的药物中的用途，其最大的优点是抗乙型肝炎病毒感染效率高，特异性强，对正常细胞无毒性,抑制率为85.2%。

一种可用于表达miR-122的载体pSU6-miR-122的构建方法（抑制乙型肝炎病毒复制），其步骤是： （表达miR-122载体构建:请见图1)

a、化学合成寡核苷酸链，有义链：5’-GGATCCAGCTGTGGAGTGTCGAAATGGTGTTTGTGTCCAAACTATCAAACGCCATTTCAACACTAAATAGCTTTTTTGGAAA-3’

反义链：5‘-AGCTTTCCAAAAAAGCTATTTAGTGTTGAAATGGCGTTTGATAGTTTGGACACAAACACCATTTCGACACTCCACAGCTGG与有义链互补，且在5’端添加上AGCT以产生粘性突出末端.

b、 有义链、反义链退火,形成带BamHI和HindIII粘性末端的片段；

c、 将以上片段连接至载体pSilencer-2.1-U6（购自Ambion公司：载体由BamHI和HindIII双酶切）；

d、 转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞（Stbl3菌株购自Invitrogen公司）；

e、 筛选阳性克隆，并测序鉴定。得到能表达miR-122的载体pSU6-miR-122质粒。

该质粒转染HepG2.2.15细胞后，其乙型肝炎病毒表面抗原的表达量降低65-68%，乙型肝炎病毒E抗原的表达量降低77-80%，对病毒衣壳(capsid)相连结的乙型肝炎病毒基因组DNA（复制中间体）的抑制率为84.2-86.4%。

一种表达miR-122的载体pSU6-miR-122在制备治疗或预防（抑制）乙型肝炎病毒的药物中的用途，其步骤是：