[发明专利]一种抗菌肽载体的构建及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达载体。具体而言，涉及通过将强抗菌活性的抗菌肽Thanatin基因序列插入到增强型绿色荧光蛋白pIRES2-EGFP报告载体中，构建出pIRES2-EGFP-Thanatin。本发明将重组表达载体通过睾丸注射，将抗菌肽Thanatin基因转入小鼠与绵羊，得到了抗菌能力强的子代动物。

背景技术

抗菌肽(antibacterial peptides)具有不同于传统抗生素的特殊作用机理，同时还具有抑杀一些病毒、寄生虫、肿瘤细胞的能力，已经成为一类具有巨大潜力的新型抗菌、抗病毒、抗寄生虫和抗癌药物。抗菌肽分子量小、热稳定性和水溶性好，随着基因工程技术的发展以及对其研究的不断深入，研究人员开始探索将抗菌肽基因转入动、植物体内，以增强动、植物的防病抗病的能力。

抗菌肽是指存在于生物体内，由生物细胞特定基因编码、具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子多肽。上世纪七十年代，由瑞典科学家Boman等从惜古比天蚕(hyatophora cecropia)中首先发现抗菌肽，并将其称为天蚕素(cecropin)。此后不久Steiner等便首次从惜古比天蚕中分离出Cecropin蛋白(NCBI蛋白质数据库ID：CAA29872)[Hultmark D，Steiner H，Rasmuson T，et al.Insect immunity：purifcation and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupa of Hyalophora Cecropina.Eur.J.Biochem，1980，106：7-16]。人们发现抗菌肽来源及其广泛，从植物、昆虫到两栖动物、哺乳动物(包括人类)都已被发现有抗菌肽的表达。迄今为止，已有近千种抗菌肽被相继分离、纯化(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)。

抗菌肽的种类繁多，但天然抗菌肽都具有以下共同特征：①分子量小，大约为4KD左右；②是由30多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，多数等电点大于7，有较强的阳离子特性，并且对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性；③具有N端亲水，C端疏水的水脂两亲性质，其中N端是稳定区，富含有赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸残基，C端富含甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸等氨基酸残基，中间连接部分富含脯氨酸残基[Jaynes J M，Burton C A，Barr S B，et al.In vitro cytocidal effect of novel lytic peptides on plasmodium falciparum and trypanosom a cruzfi.FASEB J，1989，2(12)：2878-2883.]；④绝大多数抗菌肽第2位均为色氨酸，它对杀菌活性至关重要；⑤在一定条件下形成α-螺旋和β-折叠结构，其中N端易形成α-螺旋，α-螺旋肽主要包括天蚕素(cecropin)和爪蟾抗菌肽(magainin)等，而中间部分易形成β-折叠或铰链，β-折叠肽主要包括哺乳动物防御素、植物防御素、昆虫防御素和富含脯氨酸的抗菌肽等；⑥热稳定性好，在100℃加热10～15min能保持其活性。