[发明专利]一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用。

背景技术

豇豆花叶病毒属（Comovirus）和蚕豆病毒属（Fabavirus）属于类小RNA病毒目（Picornavirales）、伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae）中的2个病毒属。豇豆花叶病毒属含有15种病毒，单个病毒的寄主范围窄，多数仅限于少数豆科植物，豇豆花叶病毒（Cowpea mosaic virus，CPMV）是其代表种。蚕豆病毒属含有4种病毒，具有较宽的寄主范围，蚕豆萎蔫病毒1号（Broad bean wilt virus 1，BBWV-1）是其代表种。这两个病毒属是一类对农业生产安全造成重要威胁的病毒，多种病毒可对其寄主植物造成严重损失。根据2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，这两个病毒属中被列为检疫性病毒的种类有：蚕豆染色病毒（Broad bean stain virus, BBSV）、菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus, BPMV）、豇豆重花叶病毒（Cowpea severe mosaic virus, CPSMV）等3种病毒。2007年Ferrer等建立了蚕豆病毒属（Fabavirus）病毒通用RT-PCR检测鉴定方法，但还未建立豇豆花叶病毒属（Comovirus）的通用RT-PCR检测方法或可同时用于这两个病毒属的通用RT-PCR方法。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用。本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否有豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒，根据序列进行种类鉴定，为进出口安全提供了保证。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测用简并引物，由正向和反向引物组成，其正向引物的核苷酸序列见SEQ ID No.1：5′- TGYGAYTAYDVHWSWTTYGATGG -3′；反向引物的核苷酸序列见SEQ ID No.2：5′- AKYARRTTRTCATCHCCATA -3′；其中Y= C/T，D= G/A/T，V=G/A/C，H=A/T/C，W=A/T，S=G/C， K= G/T，R= A/G。

一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测的检测方法，包括如下步骤：以样品总RNA为模板，利用上述引物进行RT-PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段的位置判定结果，病症叶片中均能检出326~343 bp的DNA片段。

所述的RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。

所述的反转录反应的温度为42℃，PCR扩增的先用退火温度42℃进行5个循环，然后用退火温度52℃进行30个循环，延伸温度为72℃。

一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测用简并引物的应用，所述的引物对样品总RNA进行RT-PCR扩增后对所扩增的DNA片段进一步序列测定后，能快速鉴定豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属的病毒种类。

一种豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测用简并引物的应用，所述豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测用简并引物能应用于豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒通用RT-PCR检测试剂盒。

本发明的有益效果为：本发明根据豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒RNA1基因组上的RdRp基因序列设计简并引物，该引物可用于豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒的通用RT-PCR检测。而且本发明引物及相关试剂可组装成试剂盒，以方便使用。本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否有豇豆花叶病毒属和蚕豆病毒属病毒，根据序列进行种类鉴定，为进出口安全提供了保证。

附图说明