[发明专利]一种转基因番茄特异性检测靶序列、质粒标准分子及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，主要涉及一种转基因番茄Zeneca B，Da，F品系的基因特异性和构建特异性的检测靶序列、质粒标准分子及其核酸检测试剂盒。

背景技术

自1996年全球第一例商品化的转基因番茄问世以来，由GMCs加工的转基因食品和食品成分达4000余种。随着GMCs的大规模种植和商业化生产，其安全性问题受到广泛关注。欧盟、韩国、日本等相继制定了转基因产品的标签制度；我国于2001年开始实施标签制度，2002年施行《农业转基因生物标识管理办法》，将玉米、大豆、油菜、棉花和番茄列为第一批实施标识管理的GMCs。转基因番茄，一方面作为生物反应器，用以生产医药用重组蛋白、抗体的研发；另一方面，用于培育具有延熟、抗虫等性能的的番茄良种品系。其中已商品化的转基因番茄共有Zeneca B，Da，F番茄、Bioscein(华番1号，商品名：百日鲜)等九种品系。目前，我国番茄转基因成分的相关检测技术研究较玉米、大豆等农作物略有滞后。在九种商品化的转基因品系中只有Bioscein的检测研究较为全面。我国国家质量监督检验检疫总局2006年颁布了番茄中转基因成分的定性PCR检测方法行业标准(SN/T1816-2006)，而转基因番茄的标准物质研究国内外尚未见报道。

转基因番茄Zeneca B，Da，F品系是由美国捷利康公司(Zeneca Seeds)研发，于1994年在美国和1996年在加拿大批准上市。B，Da，F品系是利用根癌农杆菌介导转化技术培育而成，目的基因是部分多聚半乳糖苷酶(polygalacturonase，pg)，可抑制番茄自身pg表达而具有延熟特性，便于储藏和运输。Da，F品系表达载体为pJR16S，内含部分正义的pg基因；B品系表达载体是pJR16A，内含部分反义的pg基因。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)广泛应用于转基因产品的检测。qPCR常通过对转基因产品的标准物质(reference material，RM)进行梯度稀释，而构建检测用标准曲线的方法来实现定量。基于拷贝数计算的qPCR定量，实验证实质粒可以替代GMCs的基因组作为核酸标准物质。

在构建qPCR定量检测体系中，RM用作阳性对照和配制不同浓度的定量检测的标准品，用于对GMCs混合水平进行量化和分析。在转基因定量检测过程中，RM必须经过严格试验验证其均匀性、稳定性和定值。高纯度、定值准确可靠、良好的溯源性和系列性是有证标准物质的特点。目前获得欧盟IRMM(Institutefor Reference Materials and Measurements)认证以及应用的有证标准物质(certified reference material，CRM)的GMCs，如含量为0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的转基因玉米Bt-176等，已不能满足现阶段快速增长的GMCs监控的需求。质粒容易获得，储存简单，高稳定性以及普遍适用性等优点，实验证实可以成为替代基因组的标准物质；质粒不仅操作简单、定量简单而且可以避免因为植物某些组织的基因结构不同而导致的转基因含量的不一致。作为核酸标准物质，质粒标准分子插入的内标准基因与外源基因比例是恒定的，能够应用于转基因定量检测。

2009年Reiting报道，GMCs亚麻品系CDC Triffid FP967(加拿大University ofSaskatchewan)研发，于1996年在加拿大、1999年在美国批准生产及流通，在2001年退市。然而在2009年在检测欧洲市场亚麻样品中，CDC Triffid亚麻FP967构建特异性呈阳性反应。这事件说明了尽管已退市的GMCs，其外源基因有可能发生基因的逃逸等情况而可能对生态安全性造成影响。所以，对退市或者未获批准的转基因作物，建立其国际标准化的检测体系都是必需的。Roning等人在2003年根据转基因玉米Bt11品系的表达载体序列设计特异引物，运用反向PCR技术扩增得到外源基因插入玉米基因在边界序列，从而设计转基因玉米Bt11品系特异性的引物和探针，同时获得的序列与美国FDA在1995年对转基因玉米Bt11品系品系的解除控制书中公布的表达载体的序列相吻合。Reiting根据GMCs数据库AGBIOS针对CaMV35S启动子和NPTII基因序列之间的连接区域序列设计特异性引物和探针，并能有效的检测如转基因玉米，转基因棉花和转基因油菜等不同品系GMCs。这些均证实GMCs中外源基因在成功导入作物基因组后，其导入序列是稳定，此也即我们能针对插入序列建立GMCs核酸检测的重要科学基础。