[发明专利]叶酸分子靶向磁性纳米药物载体及靶向基因药物的制备方法

权利要求书

1.一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1）醛基化海藻酸钠（ASA）溶液的制备：将海藻酸钠（SA）溶于水中，加入强氧化剂，反应24-36h，加入乙醇终止反应；其中，海藻酸钠的质量：强氧化剂的质量：水的体积：乙醇的体积=1g：0.2-0.3g：20-30ml：1-2ml；

2）磁性纳米粒子MNPs溶液的制备：将亚铁盐、铁盐溶于水中，调节pH至9-10，搅拌，直至溶液颜色变为深黑色，取上清液，备用；其中，Fe²⁺的物质的量：Fe³⁺的物质的量：水的体积=1mol：0.4-0.6mol：80-120L；

3）醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备：将步骤1）中的ASA溶液与步骤2）中的磁性纳米粒子MNPs溶液混合，80-90℃下反应30-50min，取上清液，备用；

4）叶酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH₂的制备：将叶酸（FA）、二环己基碳二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合于非质子有机溶剂中，反应4-8h，加入PEG₂₀₀₀（NH₂）₂，反应8-10h，加水，过滤除去不溶物得FA-PEG-NH₂溶液；其中，叶酸（FA）的质量：二环己基碳二亚胺（DCC）的质量：N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的质量：非质子有机溶剂的体积：水的体积=1g：1.2-1.5g：0.3-0.5g：40-60ml：180-240ml；

5）FA-PEG-ASAMNPs的制备：将步骤3）中的得到的ASAMNPs与步骤4）中得到的FA-PEG-NH₂溶液在0.3-0.6mol/L的硼酸钠溶液中混合，再加入硼氢化钠，室温下反应8-10h，得到产物，其中，ASAMNPs质量：FA-PEG-NH₂溶液中的FA-PEG-NH₂质量：硼酸钠溶液体积：硼氢化钠质量=1g：0.5-1g：30-50ml：0.3-0.5g。

2.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述的强氧化剂为NaIO₄。

3.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤1）中，反应温度为4-8℃。

4.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：所述的亚铁盐为FeSO₄·4H₂O。

5.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：所述的铁盐为FeCl₃·6H₂O。

6.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤2）中，调节pH是通过加入25%（w/w）NH₃·H₂O来调节的。

7.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤3）中，ASA溶液与MNPs溶液体积比为1：1-2。

8.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤4）中，所述的非质子化有机溶剂为乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、六甲基磷酰三胺、苯、乙醚、四氯化碳中的一种。

9.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤5）中，所得产物在蒸馏水中透析3-5天，干燥。

10.一种靶向基因药物的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1）醛基化海藻酸钠（ASA）溶液的制备：将海藻酸钠溶于水中，加入强氧化剂NaIO₄，反应24-36h，加入乙醇终止反应；其中，海藻酸钠的质量：强氧化剂的质量：水的体积：乙醇的体积=1g：0.2-0.3g：20-30ml：1-2ml，反应温度为4-8℃；

2）磁性纳米粒子MNPs溶液的制备：将亚铁盐、铁盐溶于水中，调节pH至9-10，搅拌，直至溶液颜色变为深黑色，取上清液，备用；其中，Fe²⁺的物质的量：Fe³⁺的物质的量：水的体积=1mol：0.4-0.6mol：80-120L；

3）醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备：将步骤1）中的ASA溶液与步骤2）中的磁性纳米粒子MNPs溶液混合，80-90℃下反应30-50min，取上清液，备用；

4）叶酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH₂的制备：将叶酸（FA）、二环己基碳二亚胺（DCC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合于非质子有机溶剂中，反应4-8h，加入PEG₂₀₀₀（NH₂）₂，反应8-10h，加水，过滤除去不溶物得FA-PEG-NH₂溶液；其中，叶酸（FA）的质量：二环己基碳二亚胺（DCC）的质量：N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的质量：非质子有机溶剂的体积：水的体积=1g：1.2-1.5g：0.3-0.5g：40-60ml：180-240ml；

5）MMP-9-ASODN的合成：根据人MMP-9基因cDNA序列，选择含起始密码子及上游的6个碱基及后续的11个碱基，共20个碱基作为靶序列的反义寡核苷酸（ASODN），MMP-9反义序列如下：5’-TGCCAGAGGCTCATGGTGAG-3’（SEQ ID NO.1），无义序列为：5’-CGTCCCTATACGACC-3’ （SEQ ID NO.2），上述寡核苷酸碱基均采用硫代修饰，5’氨基（NH₂）修饰；

6）FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物的制备：取ASAMNPs、FA-PEG-NH₂、硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN，搅拌均匀，于4-8℃下避光反应24-36小时，加入一定量的硼氢化钠溶液，使体系中硼氢化钠的浓度为0.5-0.7mol.l^-1，体系继续反应3-6小时后，充分离心沉淀，沉淀物用0.01mol/L的PBS溶液重新分散均匀，制备成FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的磁性纳米复合物；

步骤6）中，ASAMNPs溶液体积：FA-PEG-NH₂溶液体积：硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN溶液体积=1：0.25-0.35：0.15-0.25，硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN溶液中，MMP-9-ASODN的浓度为95-105μmol.l^-1。