[发明专利]一种萤火虫荧光素酶的编码基因及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子酶学与生物技术，更具体涉及一种高热稳定性及高酶活萤火虫荧光素酶的编码基因，同时涉及该突变株编码基因的制备方法。该突变基因编码的高热稳定性及高酶活萤火虫荧光素酶突变株蛋白的用途，萤火虫荧光素酶的编码基因可以广泛应用于食品、医药及生物等领域。

技术背景

荧光素酶是现今生物领域中最重要的工具酶之一，北美萤火虫荧光素酶是其中应用较广泛的荧光素酶，其由于不需要激发光源，发光能量主要来自化学反应并且发光可持续一定的时间得到科研，医药及食品行业的青睐。

在科研领域，萤火虫荧光素酶较突出的应用在于它可以作为报告基因来使用。其内源性低，哺乳动物无内源性表达；荧光素酶检测不受其他物质的影响；采用发光检测，简单易操作；并且检测灵敏度高，检测范围广。还可用于细胞增殖，细胞毒性检测等其他方面的应用。

在医药行业，特别是在做新型药物筛选方面，很多公司都采用萤火虫荧光素酶来筛选新型药物，可以实现快速，便捷，高通量的筛选，大大提高了工作效率，节省了时间，对于新药物的筛选有着很大的贡献。

在食品卫生行业，萤火虫荧光素酶同样有着重要的作用。由于萤火虫荧光素酶其中一个底物是ATP，而ATP是细胞能量的直接来源，存在于从微生物到高等动植物细胞的所有生物体中，通过ATP的测定可以直接反应细胞或微生物的含量。2005年，卫生部发布的《卫生监督机构建设指导意见》中规定省、市、县三级卫生监督机构必须配备ATP荧光检测仪，用于食品卫生和医疗卫生的现场检测。

虽然萤火虫荧光素酶存在着重要的应用价值，但由于该酶自身存在的热稳定性差，抗蛋白酶降解功能较差的缺陷，故有很多针对提高萤火虫荧光素酶稳定性或酶活方面的改造，以期更好的发挥和实现萤火虫荧光素酶的功能和作用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种萤火虫荧光素酶的编码基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及所述的序列编码的突变体酶，该突变酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。在北美萤火虫firefly luciferase基因中通过overlap PCR引入突变，连接于表达载体，生产高热稳定性及高酶活特性的FIREFLYLUCIFERASE突变酶，该突变酶的发光强度是野生型的15-20倍左右，并且较野生型具有良好的热稳定性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种高热稳定性及高酶活特性的荧光素酶突变株蛋白的制备方法，该方法是构建原核表达载体，利用亲和层析方法纯化高酶活高热稳定性的萤火虫荧光素酶，该方法简单易行，操作简便，成本低廉。

本发明还有一个目的是在于提供了一种高热稳定性及高酶活特性的荧光素酶突变株蛋白在食品、医药上的应用，其中一个比较重要的应用就是利用该突变酶在菌体检测中的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明的一个目的是提供一种核苷酸序列，该序列编码一种高热稳定性及高酶活特性的荧光素酶突变株蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其特征是在野生型firefly luciferase基因上具有1060位由G突变为A，1267位由A突变为T，1307位由A突变为G，1589位由T突变为G的4个点突变。

一种高热稳定性及高酶活特性的荧光素酶突变株蛋白的编码基因的制备方法，其步骤是：

1.突变酶FIREFLY LUCIFERASE-E354K，I423L，D436G，L530R突变位点的引入：

(1)设计两组诱变引物，采用overlap-PCR的方法将实验室购买的Promega公司的pGL3-Basic Vector质粒上的野生型firefly luciferase(源于北美萤火虫)基因1060位由G突变为A，1267位由A突变为T，1307位由A突变为G，1589位由T突变为G；其中第一次用一组诱变引物引入1267位，1307位及1589位的突变；

(2)上述PCR产物经胶回收纯化后，通过购买的Promega公司的pGEMT-vector试剂盒连接载体，将连接产物pGEMT-firefly luciferase-I423L，D436G，L530R转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得DH5α-pGEMT-fireflyluciferase-I423L，D436G，L530R；