[发明专利]抗小儿腹泻的牛初乳制品

说明书

技术领域

本发明涉及抗小儿腹泻的牛初乳制品，特别是抗轮状病毒的牛初乳制品。

背景技术

A组轮状病毒（ARV）主要侵袭婴幼儿，是致婴幼儿病毒性肠炎的主要病原体，据世界卫生组织（WHO）报道全世界每年约有100多万儿童死于轮状病毒腹泻，是发展中国家婴幼儿腹泻死亡的首位原因，1999年底至2000年初，在我国北京、深圳等地方曾大面积爆发婴幼儿轮状病毒性腹泻。

免疫乳是指给哺乳动物（主要是牛、山羊等）选择性地接种一些能够引起人或动物疾病的细菌、病毒或其他一些外来抗原（Antigen），刺激机体发生免疫应答以分泌特异性的抗体（Antibody）进入乳中，这种含有特异性抗体的乳即为免疫乳。免疫乳的外观与普通初乳的外观无异，但在功能上则发生了重大变化，对目标抗原（致病微生物或毒素）的中和效价显著提高。免疫乳中的抗体（即免疫球蛋白）能够参与机体的黏膜免疫反应，特异性地中和或消除相应的抗原（细菌或病毒），防止病原性肠道感染及相关疾病的发生。

目前对A组轮状病毒（ARV）治疗上均不够理想，目前大多采用支持疗法，主动免疫效果不理想。近年来，有些学者曾以抗-ARV 鸡卵黄免疫球蛋白（简称anti-ARV IgY）灌喂小鼠，小鼠获得了被动免疫保护，但尚未用于人类。

发明内容

本发明目的在于利用A组轮状病毒（ARV）处理制成抗原，分别免疫健康妊娠乳牛，然后用生物技术处理牛乳，可以获得抗小儿腹泻的牛初乳制品。

抗小儿腹泻的牛初乳制品，该技术方案是通过下列步骤实现的：A组轮状病毒（ARV）抗原的制备，A组轮状病毒（ARV）抗原的免疫，免疫乳的收集，免疫乳制成乳制品。

其中A组轮状病毒（ARV）抗原的制备有以下步骤：

（1）       MA104细胞的培养

MA104细胞是一种常用的生物制品，具体见《 中华实验和临床病毒学杂志 》1998年 12卷 3期记载的“MA104细胞牛轮状病毒受体的提纯及鉴定”。天津医科大学可以提供MA104细胞。

从液氮罐中取出一瓶保存的MA104细胞,37℃速融,在无菌室接种到培养瓶中，放于37℃的CO₂培养箱培养；

培养液的配制：MEM粉（GIBCO）9.0-10.0g溶入850mL五蒸水中；将2% L-谷氨酰胺，0.15mol丙酮酸钠，双抗（10000单位的青霉和12500单位的链霉素）母液分别按1%加入850mL MEM溶液中；定容至1000mL，抽滤除菌，分装，-20℃冻存。

上海源叶生物科技有限公司是专业从事生物化学及分子生物学试剂的开发商，可以提供MEM粉（GIBCO）。

（2）轮状病毒的培养

取1mL 购自中国科学院北京病毒研究所的人-Wa株轮状病毒毒种加入胰蛋白酶至终浓度为10μg/mL，在37℃条件下作用30min；将已经贴壁生长的MA-104细胞培养瓶用D-Hanks液洗一遍,以除去未贴壁细胞；加入150??L作用后的病毒于培养瓶中,均匀分布于瓶底,37℃,平放,作用1小时；加入维持液（98mL MEM细胞培养液+2mL标准小牛血清）10mL至细胞病变。

D-Hanks液是常用洗液，其配方是公知的，也是由商家可以提供的，例如可以由研域(上海)化学试剂有限公司提供。

（3）轮状病毒全菌抗原制备

抗原与弗氏佐剂等体积混合，乳化，制成油包水疫苗。

A组轮状病毒抗原的免疫具体操作为：在颈部肌肉注射或乳房周围的皮下注射；第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后用弗氏不完全佐剂代替完全佐剂进行免疫，抗原15mL与弗氏佐剂或弗氏不完全佐剂10mL混合，乳化，制成油包水疫苗，共25mL/头/次；

第一次免疫       分娩前12周     25mL/头/次

第二次免疫       分娩前10周     25mL/头/次

第三次免疫       分娩前8周      25mL/头/次

第四次免疫       分娩前7周      25mL/头/次

第五次免疫       分娩前6周      25mL/头/次

第六次免疫       分娩前5周      25mL/头/次

其中免疫乳的收集时间为在母牛分娩后的72小时以内，每隔8 小时收集一次初乳，以后每天收集一次，共收集7天,-20℃储存。

其中免疫乳制成牛初乳制品有如下步骤：

（1）过滤和冷却