[发明专利]一种表达HSA-vMIP-Ⅱ融合蛋白的酵母表达体系及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种能够高效表达HSA--vMIP-Ⅱ融合蛋白的酵母表达体系及其构建方法。

背景技术

卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma, KS)是一种血管多发性肿瘤，常见于免疫缺陷病的患者。自从AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)流行以来，KS己成为非洲地区最常见的肿瘤之一。对KS或可能患有KS的高危人群进行活检，发现了卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associate herpsvirus, KSHV)的基因组DNA，该病毒又称人疱疹病毒8 (HHV8)，表明KSHV参与了KS的病理发生过程。

卡波氏肉瘤病毒是HIV感染者或移植病人用免疫抑制剂后常发生的Kaposi肉瘤的病原体。此病毒共有80余个基因，其K6和K4基因分别编码一个类似于人单核细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)的蛋白产物病毒巨噬细胞炎症蛋白I（viral macrophage inflammatory protein-I，vMIP-I）和病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ（vMIP-Ⅱ），vMIp- I由289 bp的开放阅读框(ORF) K6基因编码，蛋白分子大小为10.5 KDa，与hMIP-1β的氨基酸序列同源性为37.9%，vMIP-Ⅱ是由ORF K4基因编码的10.5KDa蛋白，与hMIP-1a的氨基酸序列同源性为41.1%，vMIP-I和vMIP-Ⅱ的同源性为48%，两者的基因序列有70％的一致性，而另一种vMIP-Ⅲ与两者基因相比只有37％的同源性。

vMIP-Ⅱ全基因编码94个氨基酸，成熟蛋白为74氨基酸，与人的MIP同源性高达41％，其中8种非极性氨基酸占40％，具有较强的疏水性。vMIP-Ⅱ蛋白与人类的CC类趋化因子在氨基酸序列上有较高的同源性。vMIP-Ⅱ蛋白的二级结构和折叠方式与趋化因子有相同之处，但也存在差异，即使在较高的浓度水平上也呈单体结构，正是这种单体结构使它能够采取任何一种二聚体形式与细胞表面的受体结合，从而解释了它与趋化因子受体之间有交叉连接关系。vMIP-ⅡN末端的受体结合部位高度无序，在保守的半胱氨酸区有带正电荷的氨基酸残基，而CC类趋化因子通常有疏水性或中性氨基酸残基，这一区域对CC 类趋化因子二聚体形成起着重要作用，从而说明vMIP-Ⅱ缺乏二聚体结构的原因。vMIP-Ⅱ与趋化因子受体结合区域主要是非典型区域，这一区域主要包括两个部位参与受体的结合及活化：一个是蛋白N末端的近8～10氨基酸残基，另一个是N－loop环。vMIP-Ⅱ三维结构是通过2个二硫键和由β片层、C 端超螺旋结构形成的疏水核团来维持。vMIP-Ⅱ蛋白可以广谱地结合CC和CXC两类趋化因子家族受体，如CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CCR8、CCR10、CXCR4、CX3CR等10余种趋化因子受体。用来源于vMIP-ⅡN末端的V1肽段对vMIP-Ⅱ结构和功能进行研究，结果表明，Val-1、Arg-7、Lys-9残基对vMIP-Ⅱ结合CXCR4受体起重要作用。因此vMIP-Ⅱ蛋白不仅能够通过与趋化因子受体结合在免疫炎症病理反应中发挥作用，而且还可以作用于免疫细胞上的趋化因子受体，通过激动或拮抗受体来调节免疫细胞的功能，在HIV感染／艾滋病和移植排斥反应等方面有更多的研究应用价值。vMIP-Ⅱ能与作为HIV感染的辅助受体的趋化因子受体结合，干扰HIV的gp120与辅助受体的结合而可以抑制HIV的感染。试验证实，对于HIV-1病毒89.6株（可以广泛的利用辅助受体CCR3、CCR5、CXCR4进行感染），vMIP-Ⅱ可以具有与RANTES和SDF-1a相同或者稍差的阻断其利用CCR5和CXCR4受体的作用。进一步研究证实，vMIP-Ⅱ结合CCR5的结合部位和分子机制不同于RANTES (CCL5) 和MIP-1α，并具有更高的结合常数。利用NMR研究认为，vMIP-Ⅱ是在单体状态下发挥作用的。已有报道，克隆表达的vMIP-Ⅱ具有野生型vMIP-Ⅱ的活性。