[发明专利]一种在线快速检测甜叶菊糖苷的方法

说明书

技术领域

本发明属植物化学、天然产物化学、食品化学、分析化学、有机化学、生物化学、植物次生代谢物质的生理学、植物生物活性物质、甜叶菊糖苷的提取和纯化及结晶、甜叶菊的栽培和育种、糖苷作为甜味剂在食品、药品中的安全检测领域，特别涉及一种在线快速检测甜叶菊糖苷的方法。

背景技术

目前糖尿病患者逐渐增加，另外正常人过量摄取可吸收性糖也不利于身体健康，为此具有与蔗糖口感相近，同时为非吸收性糖的甜味剂开发利用是今后的发展方向。

在世界上许可添加的几大类甜味剂中，一部分来自化工合成或天然糖的改性，另一部分来自于植物。随着人们生活水平的不断提高，越来越倾向于使用天然植物无能量甜味剂。

在天然植物无能量甜味剂中甜度比较高的有甜叶菊植物，其糖作为甜味剂广泛应用是1970年代之后的事，历史比较短。甜叶菊植物中有7种甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(Stevioside)和450倍的RA(Rebaudioside A，或称为甜菊A3：Stevioside A3)。由于其甜度高、无能量等特性而被广泛地应用于食品、保健品、药品、化妆品、抗氧化食用商品、饲料添加剂等行业。

2008年12月美国FDA批准了95％以上纯度的甜叶菊糖苷可以应用在食品、饮料等方面，为此全球对糖苷的需求量剧增，国际市场80％甜叶菊糖苷来自于中国，其纯度一般在90％左右，达不到95％的标准，为了能够满足国际要求，监控提纯水平的在线检测技术开发就势在必行。目前分析检测方法有(1)分光光度计比色(黄海水，林静1990；付宝忠，史立华1995；项秀珠，郭秀珠1996)、(2)薄层色谱(黄雨三2003)、(3)高压液相色谱(黄晓兰，倪尔葭1990)、(4)毛细管电泳(邵寒娟，胡涌刚2001)、(5)铁氰化钾-鲁米诺体系的流动注射化学发光法(郝再彬，杨丹2006)等。我国对甜叶菊糖苷的检测标准是基于高压液相色谱发的GB8270-1999。

各种检测方法的缺点：薄层色谱法所用的化学试剂比较多，适合于小样品的纯化；高压液相色谱法和毛细管电泳法仪器比较贵，同时要有该专业技术人员，一般甜叶菊糖苷加工厂不易实现，另外专用色谱纯的流动相和色谱柱比较贵，以及高压液相色谱法和毛细管电泳法等仪器不方便携带，在农业甜叶菊的育种和栽培生产中的随时监控等实际应用比较困难。这几种方法都适合于大学及研究所对甜叶菊糖苷的研究；相比之下，流动注射化学发光法操作简单，检测成本低，容易克服上述不足，做常规性测定易于被生产厂家所应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种在线快速检测甜叶菊糖苷的方法。

具体步骤为：

用0.08～0.12mol/L H₂SO₄作为溶剂配制5.0×10^-4mol/L的硫酸铈铵(Ce(IV))，用二次蒸馏水作为溶剂配制1.0×10^-2mol/L的Na₂SO₃溶液，用二次蒸馏水为溶剂配制浓度为10mg/mL甜叶菊糖苷标准溶液和样品甜叶菊糖苷溶液。主动泵分别将上述浓度的载流Na₂SO₃溶液和甜叶菊糖苷标准溶液以30～60r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入流动注射化学发光分析仪。待基线平稳后，副动泵将硫酸铈铵溶液以50～80r/min的流速通过十六通注射阀，注样时间5～15秒，各液混合，流入流通池检测其化学发光强度，记录数据，作出标准曲线方程；然后重复上述操作过程，测试样品甜叶菊糖苷的化学发光强度，代入标准曲线方程，计算样品甜叶菊糖苷的含量。上述测试过程及各种化学试剂均保持在35℃恒温条件下，上述试剂均为分析纯。

在优化的条件下，甜叶菊糖苷标准溶液的浓度在0.001～0.5mg/mL范围内与发光强度ΔI呈线性关系，这表明可利用这一方法对甜叶菊糖苷作定量分析。

本发明所述流动注射化学发光法由于其灵敏度高，重复性好，线性范围宽，仪器设备简单，操作简单，检测成本低，可在线进行常规性测定，易于应用到工业或农业生产中。

具体实施方式

实施例：

用0.1mol/L H₂SO₄作为溶剂配制5.0×10^-4mol/L的硫酸铈铵(Ce(IV))，用二次蒸馏水作为溶剂配制1.0×10^-2mol/L的Na₂SO₃溶液，用二次蒸馏水为溶剂配制浓度为10mg/mL甜叶菊糖苷标准溶液和样品甜叶菊糖苷溶液。主动泵分别将上述浓度的载流Na₂SO₃溶液和甜叶菊糖苷标准溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入流动注射化学发光分析仪。待基线平稳后，副动泵将硫酸铈铵溶液以65r/min的流速通过十六通注射阀，注样时间10秒，各液混合，流入流通池检测其化学发光强度，记录数据，作出标准曲线方程；然后重复上述操作过程，测试样品甜叶菊糖苷的化学发光强度，代入标准曲线方程，计算样品甜叶菊糖苷的含量。上述测试过程及各种化学试剂均保持在35℃恒温条件下，上述试剂均为分析纯。