[发明专利]马铃薯致病疫霉Δ12去饱和酶基因PinD12的功能鉴定与应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及在马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)Δ12去饱和酶基因PinD12的功能鉴定与应用，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

必需脂肪酸是指人体生命活动必不可少，但人体自身不能合成，必需由食物供给的多不饱和脂肪酸。必需脂肪酸主要包括两种，α-亚麻酸和亚油酸。这两种脂肪酸可以在人体内通过其它一系列的酶催化，进一步转化成对人体具有重要生理功能的EPA和DHA等超长链多不饱和脂肪酸。

在植物体内，亚油酸是由Δ12去饱和酶催化油酸去饱和生成的。克隆、鉴定Δ12去饱和酶基因，对利用转基因技术，在油料作物中过量表达高催化活性的Δ12去饱和酶，从而将其丰富的油酸转化成亚油酸，提高植物油的营养价值，或通过转基因技术在植物特别是油料作物生产EPA和DHA，具有重要的意义。

本发明在马铃薯致病疫霉中克隆到编码Δ12去饱和酶的cDNA序列，在酿酒酵母中诱导表达发现其编码产物能够将软油酸(16∶1Δ⁹)和油酸(18∶1Δ⁹)分别转化成十六碳二烯酸(16∶2Δ^9，12)和亚油酸(18∶2Δ^9，12)，证明了其具有Δ12去饱和酶活性，转化效率最高可分别达52.1％和78.0％。

(三)发明内容

本发明首先提取马铃薯致病疫霉总RNA，反转录成cDNA后，用引物5’-GCAACCAAGTTCATCGCGTT3’和5’-TCCACCTGACGACCTTAGAG-3’做PCR，将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体pMD18-T中。生物信息学分析，得到的cDNA片段开放阅读框部分为1197bp，编码398个氨基酸的多肽，具备去饱和酶和电子传递有关的三个组氨酸框结构域(HxxxH、HxxHH和HxxHH)。该基因cDNA序列如下：

序列表

(1)SEQ ID NO.1的信息

(a)序列特征

*长度：1197碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)

(f)序列描述：SEQ IN NO.1

1 ATGGCGATCC TTAACCCGGA GGCAGAGTCA GCCGCCAAGG TGGCTACGCT GTCCGAAGCC

61 AAGCAACGTG AGCTTGCCGA GGCCGGCTAC AAGCACGTGG AAGGAGCTCC GGCGCCGCTG

121 CCGCTGGATC TGCCGCATTT CTCTCTGCGG GATCTTCGCG CTGCCATTCC CAAGCACTGC

181 TTCGAGCGCT CCTTCATTAC GTCCACGTAC TACATGATAA AGAACCTTCT CACGTGTGCT

241 GCTCTCTTCT ACGCGGCCAC CTACATCGAC CAGACTGGGA GCTTCGCCTA CCTGCTCTGG

301 CCTGTGTACT GGTTCTTCCA GGGGAGCTAC CTTACTGGCA TCTGGGTTGT GGCGCATGAG

361 TGCGGCCACC AGGCCTACTG CTCCAGCGAG GTGGTGAACA ACATGATCGG TCTCGTGCTG

421 CACTCGACGT TGCTTGTGCC GTACCACAGT TGGCGTATTT CACACCGCAA GCACCACTCC

481 AATACAGGCA GCTGCGAGAA CGACGAGGTG TTCGTACCTG TCACTCGCTC TGTGATCGCC

541 AGCTCGTGGG ACGAGACGCT CGAGGACTCA CCACTCTACC AGCTCTACCG CATCGTGTAC

601 ATGCTGGTAG TGGGCTGGAT GCCTGGCTAC CTCTTCTTCA ACGCGACGGG TCCGAGCAAG

661 TACTTGGGCA AGTCGCGCAG CCACTTCAAC CCGTACTCGT CCATCTACTC AGACCGCGAG