[发明专利]两种大豆病菌的PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒及检测方法，特别是一种大豆南方茎溃疡病菌（DPM）和大豆北方茎溃疡病菌（DPC）PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

大豆南方茎溃疡病菌（Diaporthe phaseolorum （Cke. & Ell.）Sacc.var.meridionales  Morgan-Jones，简称DPM）和大豆北方茎溃疡病菌（Diaporthe phaseolorum（Cke. & Ell.）var. caulivora Athow & caldwell，简称DPC）是我国进境植物检疫性有害生物。由于这两种病害近年来在国外发生普遍、经济影响大、传入风险高且在我国无发生报道，被国内有关专家定为大豆上7种危险性真菌病害。DPM、DPC在美国、巴西、阿根廷等大豆生产国发生面积大，引起的产量损失曾高达100%。我国是种植和进口大豆的大国，每年都收割和进口大量的大豆。大豆在我国分布很广，常年种植面积占粮食耕地面积的8—10%，仅次于水稻、小麦、玉米，在国民经济中占有重要地位。而我国进口大豆中95%以上来自美国、巴西、阿根廷和乌拉圭，2010年我国进口大豆总量竟达5400多万吨，依存度也从2000年的48.1%增至2007年的78.7%。

由于传统的形态学鉴定时间长，操作步骤复杂、繁琐，仅分离菌株后的纯培养时间就长达40-60天，给快速、准确诊断该两种病菌带来了困难。近几年来，针对这两种真菌普遍采用的诊断方法是形态学特征、PCR—RFLP、荧光PCR检测方法及测序，但很明显，PCR—RFLP、荧光PCR检测花费都很高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种能实现快速、准确、花费低，便于推广应用的大豆南方茎溃疡病菌（DPM）和大豆北方茎溃疡病菌（DPC）PCR检测试剂盒。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供用以上所述的检测试剂盒进行检测的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种大豆南方茎溃疡病菌和大豆北方茎溃疡病菌PCR检测试剂盒，其特点是，它由下列物品构成：

1)、阴性对照，成份为1mL灭菌双蒸水                     1支 ；

2)、阳性对照，试剂成份为溶于1mL 灭菌双蒸水中100ng 的DPM菌株DNA  1支 ；

3)、阳性对照，试剂成份为溶于1mL 灭菌双蒸水中100ng 的DPC菌株DNA 1支 ；

4)、dNTP                                               1支  ；

5)、不含Mg²⁺的PCR缓冲液                                1支；

6)、含Mg²⁺的缓冲液                                       1支 ；

7)、引物对DPMF₃/DPMR₂

DPMF₃为: 5’-CCGAAACTCTGAGCAAAAAACAC-3’       1支；

DPMR₂为: 5’-CCTGGCGAGCCCGCCACTAG-3’           1支；

8)、引物对DPCF₄/ DPCR₂   

DPCF₄为:5’-GCCCCCTTGGGGGCCCCCC-3’         1支；

DPCR₂ 为: 5’-TCCTGGCGAGCTCGCCAATGA-3’     1支 ；

9)、DNA聚合酶                                     1支；

10)、灭菌双蒸水                                 1支；

11)、包装盒子，一块泡沫板，其大小与包装盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中；

将阳性对照单独存放；试剂盒于-20℃保存。