[发明专利]一种应用特异引物检测烟草种质花叶病抗性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种抗花叶病烟草种质的分子检测方法，更具体地涉及一种应用特异引物检测烟草种质花叶病抗性的方法。

背景技术

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV) 属于正单链RNA病毒，是典型的模式植物病毒， 具有抗逆性强、防治难、危害大、寄主范围广等特点。烟草花叶受TMV侵染后开始表现症状，其最显著的症状有花叶、叶片畸形、植株矮缩、病叶厚薄不均、叶色浓淡不匀等。烟株受到烟草花叶病的侵害后，其烟叶烤晒后的颜色不均，烟味差，品质大幅度降低。据相关研究发现烟草花叶病毒可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科及苋科等36科植物及包括烟草、番茄、茄子、辣椒、菠菜在内的350种植物。

烟草花叶病已经在世界各烟区普遍发生。烟草花叶病的危害日趋严重，筛选抗花叶病的烟草种质成为防治烟草花叶病最直接、最经济、最有效的措施，其中检测烟草种质对烟草花叶病(TMV)的抗性，则是必不可少的重要环节。

抗烟草花叶病基因（CN）是一个单显性基因，属于NBS-LRR类R基因之一，也是目前已经报道的抗烟草花叶病基因中对抗TMV比较有效的基因之一，其结构、功能及表达特点都已进行了研究，但利用特异引物进行烟草种质花叶病抗性的检测还较少见。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用特异引物检测烟草种质花叶病抗性的方法，以满足在分子水平上对烟草种质抗花叶病特性进行检测的需要，从而解决传统的田间检测易造成污染的问题。

本发明的用于检测烟草种质抗花叶病特性的特异引物CNF和 CNR，其具体核苷酸序列为：CNF：5’-AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3’和 CNR：5’- CGCAACCCGTA TTCAACTCC -3’。

利用所述的特异引物检测烟草种质花叶病抗性的方法，其步骤为：利用特异引物对待检测烟草种质的基因组DNA进行PCR扩增，如果能特异性地扩增出565 bp的产物，即可判断其抗性。

本发明特异引物的设计与获得过程为：采用改良的CTAB法提取抗花叶病烟草种质基因组DNA。利用GenBank上登录的抗花叶病基因（CN）的核苷酸序列设计一对特异引物CNF和CNR。用设计好的特异引物CNF和CNR扩增抗花叶病基因序列。然后将PCR产物克隆到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取重组子质粒DNA ，并根据质粒DNA的PCR检测结果，选取阳性克隆进行测序并进行序列分析。测序分析结果表明该引物扩增的核苷酸序列与其它抗花叶病基因保守序列的同源性达到88%。采用DNAMAN6.0软件对该引物扩增的的基因片段序列与其它抗花叶病基因的片段序列进行多重序列比较，比对结果表明该引物扩增的核苷酸序列与其他抗花叶病基因的核苷酸区域均含有1个保守核苷酸序列区域NBS域。

附图说明

图1为抗花叶病烟草种质的基因组DNAPCR扩增产物回收后的电泳检测图；

图2为阳性重组子的PCR检测图；

图3为不同类型的烟草种质DNA片段的PCR扩增图；其中编号1-46对应待测来源于3种烟草种质材料的46个烟草资源的具体编号。

具体实施方式

实施例1

该实施例所用药剂及载体等均为TAKARA公司购买。

1、特异引物的获得与特异性检测

（1）抗花叶病烟草种质基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法，提取福建省烟草科研所提供的抗花叶病烟草种质的基因组DNA。

（2）烟草抗花叶病基因的PCR检测

以CNF：5’-AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3’和 CNR：5’- CGCAACCCGTA TTCAACTCC -3’为引物，扩增并得到烟草抗花叶病基因的PCR产物，如图1所示，其核苷酸保守序列长度为565bp。将PCR产物克隆到pMD18-T转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取重组子质粒DNA ，并根据质粒DNA的PCR检测结果（图2），选取阳性克隆进行测序。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

连接体系与连接反应：

（3）测序结果分析