[发明专利]纳米颗粒分子单倍型分型方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物遗传技术领域的方法，具体是一种纳米颗粒分子单倍型分型方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组序列上单个碱基的颠换，插入或者缺失。常见SNP在人群中的最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)大于5％，具有较高的多态性。在人类的染色体中，绝大多数SNP只具有两个等位基因，这给基因分型和统计分析带来便利。而且，SNP在人类基因组中分布广泛，从2006年的数据可以得知，平均每1000个碱基就会发生一个SNP。随着“1000个基因组”计划和第二代测序技术的出现，这一密度还可能增加。SNP的这三大优点，高多态性、两等位基因性和分布广泛性，使它成为寻找复杂遗传疾病易感基因的利器。

复杂遗传疾病通常由多个微效致病基因和环境因素共同作用而形成。这些微效致病基因对疾病发生的贡献都很小，通常单独一个微效致病基因的致病突变并不足以导致疾病的发生，而多个微效致病基因的致病突变与环境因素的共同作用增大了发病的可能性。

在寻找复杂遗传疾病易感基因的过程中，人们大量的以SNP作为分子标记，关联分析作为统计方法。关联分析通过观察多态性标记的等位基因频率在病例组和对照组中的差异，来确定某个等位基因是否与致病突变处于连锁不平衡，从而确定致病突变所在的染色体区段。关联分析的结果能在一定程度上和一定概率上缩小目标范围，甚至可以确定风险基因。然而，对于精神疾病这类拥有众多微效基因，遗传模式还不十分清楚的复杂遗传疾病来说，从单个位点的关联分析结果很难得到启示性的结果。这时，就需要一种可以提高统计效力并具有更多多态性的分子标记，单倍型。SNP的单倍型是染色单体上多个SNP的等位基因的排列。分析表明，单倍型关联分析相比于单个位点的关联分析具有更高的统计效力。对于存在强连锁不平衡的染色体区域，单倍型分析也可以过滤掉由SNP位点之间的连锁不平衡而出现的多个阳性位点，从而凸显出真正的致病突变。

然而，获得个体的单倍型信息对基因分型技术来说还是个严峻的挑战。大多数现在的基因分型技术对于分离两条染色单体都无能为力，特别是SNP分型技术在这方面更是欠缺。因此，通过分子单倍型分型，获得个体真正的单倍型信息就显得尤为重要。截至目前，几乎所有的SNP分子单倍型分型方法都处于实验室阶段，它们或者不能完全分离两条染色单体(ASPCR)，或者程序繁琐，涉及多步反应，成本高昂(酶切-连接法和体细胞杂交)，或者技术本身具有很大不确定性(单分子PCR法)。这些缺点阻碍了它们成为高通量单倍型分型技术的核心。

ASPCR的作用在于区别多个等位基因。最初，ASPCR主要被用于基因分型。以SNP为例，它们通常有两个等位基因。设计一个通用反向引物(universal reverse primer)，一对分别对应两个等位基因的正向特异性引物(specific forward primer)，这些正向引物通过3’端序列与其中一个等位基因特异性杂交。在进行PCR反应前，分别向两个PCR反应体系中加入一条特异性引物和通用引物。正向引物特异性地与染色体上两个等位基因中的一个杂交，并在聚合酶的作用下扩增出这个等位基因所在染色体的DNA片段。通过检查由特异性引物所产生的PCR产物的量来检测等位基因。ASPCR反应易于自动化，而且可以形成高通量。

ASPCR反应的特异性主要由特异性引物的3’端决定。对于多个碱基的突变，由于序列变化幅度较大，使得两个等位基因特异性引物的碱基互补特性有很大不同。因而ASPCR可以很好的分离多碱基突变的两条染色单体。不过，ASPCR在分离单个碱基突变的两条染色单体时，特异性随突变碱基的类型而变化。比如G:G或者A:A就不能用ASPCR方法分离，明显的错误延伸也在G:T、C:A、A:C和T:G组合中发现。所以，如果用ASPCR来分离染色单体，产物中会有来自另一条染色单体的污染，从而使得单倍型分型结果仍然带有不明确位点(ambiguous loci)。

为了提高ASPCR的特异性，人们使用了DNA的等价物，如LNA(Linked nucleic acid)和PNA(Peptide nucleic acid)，来代替特异性引物3’端碱基。LNA和PNA有效的提高了ASPCR反应的特异性，不过这类引物的合成过程很复杂，显著的提高了分型成本。