[发明专利]玫瑰黄链霉菌的一个负调控基因及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 nsdB_mgh基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列。

2.一种由权利要求1所述基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。

3.含有权利要求1所述基因的载体，或进一步包括含有该载体的宿主。

4.权利要求1所述基因在制备转基因植物或在提高植物抗虫活性中的应用。

5.权利要求2所述蛋白在制备生物杀虫剂或在杀灭植物害虫中的应用。

6.一种制备权利要求1所述基因的方法，包括如下步骤：

1）玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 nsdB_mgh基因部分片段的获得：根据GenBank登录号：1102690的天蓝色链霉菌nsdB基因的序列设计一对特异引物Ns8F：GTGGATCGACATGGGAGAGAT和Ns8R：CCATGGACAGGTAGTCGAAGAT，PCR扩增玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63基因组DNA；PCR产物电泳检测，然后将PCR产物连接到克隆载体pMD19-T上，并转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板培养，挑取阳性克隆进行测序；

2）玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 nsdB_mgh基因5’端和3’端非特异引物锚定PCR：根据步骤1）中PCR的测序结果，设计5’端非特异引物锚定PCR特异性引物GSP1：GAGCATGAGGTCCATTCCCGTGA和GSP2：CGGACCAGACCGAGATCCTCAGTG；3’端非特异引物锚定PCR特异性引物GSP3：GACGCCCTGGACCTGATGAAGCTG和GSP4：GATGCAGATGTTCGACGAGGCGG，进行非特异引物锚定PCR扩增；PCR产物电泳检测，然后将PCR产物连接到克隆载体pMD19-T上，并转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板培养，挑取阳性克隆进行测序。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中PCR反应体系为：模板DNA 50 ng，LA Taq 酶1 U，5 μmol·L-1的上、下游引物各0.5 μL，10 mmol·L^-1的dNTP 1μL，2×GC bufferⅠ缓冲液12.5 μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至25 μL；PCR反应程序为：先95℃ 5 min；然后94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min30s，共35个循环；最后72℃ 10 min，4℃保存；

随后PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR产物连接到克隆载体pMD19-T上，并转化大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取3个阳性克隆进行测序，在国际基因库上进行序列分析获得nsdBmgh基因的部分片段序列。