[发明专利]一种神经干细胞冻存复苏的方法

权利要求书

1.一种神经干细胞冻存复苏的方法，包括以下步骤：

1)冻存步骤：包括向神经干细胞悬液中加入冻存液和在液氮中冻存的步骤；

2)复苏步骤：包括向从液氮中取出的冻存细胞中加入复苏液使细胞复苏的步骤；

3)将复苏的细胞液洗涤后制备成细胞悬液备用。

2.权利要求1的方法，其中所述冻存液包含表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。

3.权利要求2的方法，其中所述EGF在冻存液中的终浓度为0.005-0.04μg/ml、优选0.008-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml。

4.权利要求2的方法，其中所述bFGF在冻存液中的终浓度为0.005-0.04μg/ml、优选0.008-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述冻存步骤包括将加入冻存液的神经干细胞悬液低温，优选在-15℃至-25℃，更优选在-18℃至-22℃，最优选在-20℃放置一段时间，然后在-65℃至-75℃，优选在-68℃至-72℃，最优选在-70℃放置12-16个小时，再转入液氮中冻存。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述冻存液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：

1×B27添加剂，

1×N2添加剂，

L-谷氨酰胺，终浓度为1.6-2.4mM

丙酮酸钠，终浓度为0.8-1.2mM

N-乙酰半胱氨酸(NAC)，终浓度0.8-1.2mM

EGF，终浓度0.005-0.04μg/ml、优选0.008-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml

bFGF，终浓度0.005-0.04μg/ml、优选0.008-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml

二甲基亚砜(DMSO)，终浓度7-8％(v/v)

牛血清白蛋白(BSA)，终浓度0.08-0.12g/ml。

7.权利要求6的方法，其中所述冻存液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：

1×B27添加剂，

1×N2添加剂，

L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM

丙酮酸钠，终浓度为1.0mM

NAC，终浓度1.0mM

EGF，终浓度0.01μg/ml

bFGF，终浓度0.01μg/ml

DMSO，终浓度7.5％(v/v)

BSA，终浓度0.1g/ml。

8.权利要求6的方法，其中所述冻存液为DMEM或DMEM/F 12培养液中包含：

1×B27添加剂，

1×N2添加剂，

L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM

丙酮酸钠，终浓度为1.0mM

NAC，终浓度1.0mM

EGF，终浓度0.02μg/ml

bFGF，终浓度0.02μg/ml

DMSO，终浓度7.5％(v/v)

BSA，终浓度0.1g/ml。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述复苏液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：

1×B27添加剂，

1×N2添加剂，

L-谷氨酰胺，终浓度为1.6-2.4mM

丙酮酸钠，终浓度为0.8-1.2mM

NAC，终浓度0.8-1.2mM

BSA，终浓度0.008-0.012g/ml。

10.权利要求9的方法，其中所述复苏液为DMEM或DMEM/F 12培养液中包含：

1×B27添加剂，

1×N2添加剂，

L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM

丙酮酸钠，终浓度为1.0mM

NAC，终浓度1.0mM

BSA，终浓度0.01g/ml

11.权利要求1-10任一项的方法，其中复苏的过程包括：

将液氮中的冻存细胞取出，在35℃至45℃，优选在38℃至42℃，最优选在40℃水浴中温育1.5-2.5分钟，然后加入复苏液重悬。