[发明专利]一种分离脂肪中无脂滴的有核细胞的方法和试剂盒无效
申请号: | 201110097318.2 | 申请日: | 2011-04-19 |
公开(公告)号: | CN102747031A | 公开(公告)日: | 2012-10-24 |
发明(设计)人: | 迟明国;蔡云松 | 申请(专利权)人: | 北京同盛颐和生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/0775 | 分类号: | C12N5/0775 |
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地址: | 101111 北京市北京经济技术*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 分离 脂肪 中无脂滴 细胞 方法 试剂盒 | ||
技术领域
本发明涉及一种用于体外分离纯化脂肪组织中无脂滴的有核细胞的方法和试剂盒。
背景技术
脂肪组织中的干细胞种类与数量仅次于骨髓组织,是人体的第二大干细胞库。临床采集骨髓和采集腹部的脂肪,两者相比,采集脂肪病人更容易接受,相比而言痛苦也小一点。近年来减肥的吸脂手术后可获得大量的脂肪,这些脂肪为干细胞分离提取提供了非常便捷的来源。本试剂盒采用的方法法可将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除,使细胞分散,形成悬液,易于从外界吸收养分和排除代谢产物,这样就可以很快得到大量活细胞,细胞也可以在短时间内生长成片。
现有技术中从脂肪中分离纯化干细胞的方法存在着干细胞活率及回收率较低等缺点。
发明内容
本发明涉及一种用于体外分离纯化脂肪组织中无脂滴的有核细胞的试剂盒以及该试剂盒的使用方法。采用本发明的试剂盒从脂肪中分离纯化干细胞干细胞活率高及回收率高。
本发明所述的试剂盒包括各自隔离包装的消化液、纯化液和悬浮液,其中消化液是溶于生理盐水的蛋白酶,其重量体积浓度为0.25%;纯化液是溶于生理盐水的聚蔗糖,其重量体积浓度为10%;悬浮液是生理盐水,优选地,各自独立包装。
本发明所述的试剂盒,其中所述的消化液∶纯化液∶悬浮液的体积比为(20-1500)∶(10-45)∶20。
本发明的试剂盒其中所述试剂盒中还包括使用说明书,所述说明书载明了所述试剂盒的使用方法,所述方法包括如下步骤:
(1)将抽取的500ml脂肪与500ml消化液完全混匀;
(2)将混合溶液放置到37℃的水浴箱中,孵育1小时;
(3)孵育完成后,用100目的滤网过滤混合溶液;
(4)将混合溶液以离心力400xg(转速1500rpm)10min的条件下离心,去除上清;
(5)用100ml生理盐水重悬沉淀细胞;
(6)将纯化液按每管15ml加到50ml离心管中,将第5步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上,保证两种液体之间的液面清晰,然后,4℃,离心力710xg(转速2000rpm),20分钟离心;
(7)离心后,吸取中间层细胞,加到新的离心管中,用50m1注射用生理盐水稀释,4℃,离心力400xg(转速1500rpm),8分钟离心洗涤细胞两次;
(8)将洗后的细胞加到悬浮液中,备用。
本发明所述的试剂盒,用于体外分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞。本试剂盒利用蛋白酶分解脂肪的原理,采用梯度离心法分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞。
本发明所述的试剂盒,使用的样品类型为用于体外分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞,可以按照通用的方法收集脂肪样本;脂肪收集后应在6小时内进行分离纯化脂肪中无脂滴的有核细胞。
本发明所述的试剂盒,回收率可以达到》90%,分离的有核细胞活率≥96%,最大程度地维持了干细胞在体外微环境的恒定。
本发明还公开了所述试剂盒的使用方法,包括如下步骤:
(1)将抽取的500ml脂肪与500ml消化液完全混匀;
(2)将混合溶液放置到37℃的水浴箱中,孵育1小时;
(3)孵育完成后,用100目的滤网过滤混合溶液;
(4)将混合溶液以离心力400xg(转速1500rpm)10min的条件下离心,去除上清;
(5)用100ml生理盐水重悬沉淀细胞;
(6)将纯化液按每管15ml加到50ml离心管中,将第5步中的细胞悬液用移液管缓慢加到纯化液的液面上,保证两种液体之间的液面清晰,然后,4℃,离心力710xg(转速2000rpm),20分钟离心;
(7)离心后,吸取中间层细胞,加到新的离心管中,用50ml注射用生理盐水稀释,4℃,离心力400xg(转速1500rpm),8分钟离心洗涤细胞两次;
(8)将洗后的细胞加到悬浮液中,备用。
本发明的细胞活率是采用如下方法进行检测的:
1吸管吸取90微升分离纯化后脂肪中无脂滴的有核细胞悬液。
2加入0.2%的台盼蓝染色液10微升,混匀。
3静置3分钟。
4吸取混合溶液,滴一滴至细胞计数板,均匀铺开后,显微镜下观察。
5显微镜下计数,蓝染的细胞为死细胞(A),无染色的细胞为活细胞(B)。
有核细胞活率=B/(A+B)*100%
具体实施方式
实施例1
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