[发明专利]基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法

权利要求书

1.一种基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于：1) 将耐3’-5’核酸外切酶消化的测序引物固定于磁性介质上，与待测DNA序列进行杂交；2) 加入成分包括不具有3’-5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶的第一步延伸反应溶液，延伸经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体，通过检测标记物信号得到核苷酸种类与个数信息；3) 加入成分包括具有3’-5’核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的第二步延伸反应溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替换延伸上耐3’-5’核酸外切酶消化的核苷酸单体；4) 对磁性介质进行磁分离并清洗；循环上述步骤2)、3)和4)所进行的过程，直到确定待测DNA中的核苷酸序列信息。

2.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述磁性介质为体现磁学性质的物体。

3.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述经过标记的脱氧核糖核苷酸单体与双脱氧核糖核苷酸单体为直接或间接标记着荧光分子、放射性同位素或酶的dNTP与ddNTP。

4.根据权利要求2所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述体现磁学性质的物体为具有磁学性质的物质构成的物体或以具有磁学性质的物质为部件的物体。

5.根据权利要求3所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于经过标记的dNTP与ddNTP，所述四种单体均标记相同的标记物，或标记不相同、不完全相同的标记物。

6.根据权利要求3所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于经过标记的dNTP与ddNTP，其中ddNTP与同种类dNTP之间的分子数比例为1:50~1:10000。

7.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述不具有3’-5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶、T7测序酶、Vent^- DNA聚合酶、DeepVent^- DNA聚合酶或测序酶。

8.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述具有3’-5’核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶为Vent DNA聚合酶、DeepVent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。

9.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述耐3’-5’核酸外切酶消化的核苷酸单体为硫化修饰的dNTPαS、环化修饰的acy-NTP或锁核酸。

10.根据权利要求1所述基于磁分离与高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于采用线性方式依次读取完整核苷酸序列或采用阵列方式读取部分核苷酸序列后再利用序列拼接软件进行拼接。