[发明专利]绵羊肺炎支原体Hsp70(DnaK)C末端基因重组质粒

说明书

技术领域

本发明属于微生物学、分子生物学与基因工程研究领域，涉及微生物学、分子生物学与基因工程的相关实验方法与技术，特别涉及一种绵羊肺炎支原体Hsp70(DnaK)C末端基因重组质粒。

背景技术

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)能感染并危害绵羊，是引起绵羊传染性胸膜肺炎(Contagious ovine pleuropneumonia)的主要致病菌，并且也能感染1-3月龄的羔羊和山羊。绵羊传染性胸膜肺炎是一种绵羊慢性呼吸道传染病，以咳嗽、喘气，渐进性消瘦及慢性增生性间质性肺炎为主，是一种世界性的传染病。

研究认为，热休克蛋白70(Hsp70)，也称DnaK，具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能，参与免疫反应，抗细胞凋亡功能，抗氧化功能，提高细胞的应激耐受性，促进细胞增殖，参与细胞骨架的形成和修复等等，广泛的生物学功能使其成为当今生命科学研究中的热点。进一步研究认为，Hsp70不仅具有良好的免疫原性，可诱导和增强机体体液免疫和细胞免疫的发生，同时它还具有免疫佐剂的功能。到目前为止，绵羊肺炎支原体基因组全序列尚未见报道。本研究在先期首次克隆获得Hsp70(DnaK)基因全长cDNA的基础上，利用DNAstar对Hsp70蛋白进行二级结构预测，分析结果显示α螺旋在整个蛋白质中均有分布，其中50-175、210-250、480-576是主要分布区，尤其是在C末端的480-576区含有大量的α螺旋结构，该结构的出现可能与蛋白质跨膜结构有关。而整个蛋白质当中β折叠较少，仅在360-380区有较少的β折叠。分析还表明C末端还具有较强亲水性，很有可能是蛋白质的抗原表位。表面抗原分析MO Hsp70的结果较为复杂，有多处区段都有可能处在蛋白质表面，其中在MO Hsp70C末端分布较为连续。在350-390区是蛋白质的跨膜区)，蛋白质的螺旋卷曲集中在218-256、472-526、530-580区。通过对MO Hsp70蛋白质二级结构的预测分析发现：MO Hsp70C末端有较强的亲水性和较多的螺旋卷曲结构；α螺旋结构在C末端也大量集中出现，这与蛋白质的跨膜结构有关；抗原表位结果显示在C末端连续分布。上述结果预测MO Hsp70C末端是抗原表位。

发明内容

本发明的目的是提供一种绵羊肺炎支原体Hsp70(DnaK)C末端基因重组质粒，从而为后续的绵羊肺炎支原体的分子生物学研究、相关疫病临床诊断试剂与基因工程疫苗的研制等奠定了坚实的基础。

本发明的目的按照下述技术方案实现：

根据MO hsp70基因序列及引物设计原则设计并合成如下引物：P2：GGGTTAATTTTGTTTGATTTC；P3：CAGACTCCTTTAACTTTAGG。其中P2和P3阴影处分别表示Sal I和BamH I的酶切位点；以质粒T-Hsp70(含MO Hsp70全长cDNA序列)为模板，利用上述引物P2、P3，进行PCR扩增得到了Hsp70C末端基因cDNA片段，片段大小约为700bp。将该片段与pET28a(+)相连接，获得了重组质粒pET28a(+)-Hsp70C，酶切鉴定与核苷酸序列测定结果表明目的基因序列和阅读框架正确。进一步将重组质粒转化至BL21(DE3)中，并对表达产物进行SDS-PAGE，得到大小约为29kDa的目的蛋白；Western blotting分析表明，目的蛋白表达特异，且可特异性识别临床血清。

本发明在前期克隆获得MO Hsp70全长基因的基础上，对Hsp70C末端基因700bp进行了克隆与原核重组质粒的构建，并对重组质粒所表达目的蛋白的生物学特性进行了初步研究。实验结果为绵羊肺炎支原体的分子生物学研究、相关疫病临床诊断试剂与基因工程疫苗的研制等奠定了坚实的基础。

附图说明

图1是本发明PCR扩增Hsp70C末端基因电泳图，其中：1.Marker2000，2.PCR电泳结果；

图2是本发明表达载体酶切电泳图，其中：1.Marker 10000；2.BamH I单酶切片断，3.BamH I/Sal I双酶切片断，4.PCR鉴定；5.Marker 2000；

图3是本发明重组质粒pET28a-Hsp70-C测序结果；

图4是本发明BL21(DE3)(pET28a(+)-Hsp70-C)表达产物SDS-PAGE图谱；

其中：1.BL21(DE3)(pET-22b(+))表达产物；