[发明专利]一种家蝇抗菌肽Cecropin A的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及混合肽，具体涉及家蝇抗菌肽Cecropin A。 

背景技术

抗菌肽在自然界中分布广泛，它在宿主对抗病原微生物中扮演着重要角色。Cecropin是最早发现的一种抗菌肽，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抑菌效果，并且其结构简单，抗菌机理明确，对哺乳动物体细胞无毒性、免疫原性低，可以广泛应用在抗菌药物制备领域。 

在细菌中表达异源性蛋白是一种技术成熟，成本低廉的方法，广泛应用在蛋白质的大规模生产上。但是，抗菌肽对工程菌具有很强的毒性作用，并且容易水解，不能直接在原核细菌表达系统中直接表达。大肠杆菌的结构简单，可以大规模、高密度发酵，一直是基因工程中多肽类药物生产研究中常用的表达宿主细胞。将抗菌肽和和分子伴侣一起在细菌中融合表达，这些分子伴侣不仅可以降低抗菌肽对细菌的毒性，还可以提高抗菌肽的稳定性。如抗菌肽和绿色荧光蛋白(EGFP)，内蛋白Pur F的F4(F4 of Escherichia coli intracellular protein)等分子伴侣一起在大肠杆菌中得到表达。但是存在抗菌肽表达量低，分离靶蛋白困难的缺点。为了满足抗菌肽的生产需要，寻找一种快速高效制备抗菌肽的方法是迫在眉睫的问题。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种家蝇抗菌肽Cecropin A的制备方法，该方法具有高效的优点。 

本发明解决上述问题的技术方案如下所述。 

一种家蝇抗菌肽Cecropin A的制备方法，该方法由以下步骤组成： 

(1)裂解家蝇的幼虫组织，抽取其总RNA，然后进行RT-PCR扩增，分别得到cecropin A基因片段和ubiquitin基因片段； 

(2)将cecropin A基因片段和ubiquitin基因片段分别与pMDTM18-T载体连接，并转入DH5α大肠杆菌，分别得到转cecropin A基因的大肠杆菌和转Ubiquitine基因的大肠杆菌； 

(3)先从转cecropin A基因的大肠杆菌提取出pMD18-T-cecropin A重组质粒，再对pMD18-T-cecropin A重组质粒进行PCR扩增，将纯化得到的Cecropin A成熟肽基因片段与 pET32a载体分别酶切后相连并转入DH5α大肠杆菌，然后提取出pET32a-MC重组质粒；接着，将转Ubiquitine基因的大肠杆菌进行PCR扩增，将纯化得到的ubiquitin基因与pET32a-MC重组质粒分别酶切后相连并转入DH5α大肠杆菌，然后提取出pET32a-ubiquitin&MC重组质粒； 

(4)将pET32a-ubiquitin&mc重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞，筛选取阳性细胞，加入异丙基硫代半糖苷(IPTG)进行诱导表达，收集菌体，进行超声波破碎，纯化分离，得到Trx&MC融合蛋白质； 

(5)采用胃蛋白酶对Trx&MC融合蛋白质进行水解得到获得家蝇Cecropin A天然成熟肽； 

其中，所述的RT-PCR扩增引物分别为： 

Cecrop in A上游引物序列为5’-ATGAATTTCAATAAATTATTTG-3’(SEQ NO.1)， 

Cecropin A下游引物序列为5’-TTAACCCTTTAATGTGGCGGC-3’(SEQ NO.2)， 

Ubiquitine上游引物序列为5’-GCGGAATTCATGCAGATTTTCGTGAAAACCTTGAC(SEQ NO.3)， 

Ubiquitine下游引物序列为5’-TAAAAGCTTTGCCACCGCGCAGGCGAAGGACC(SEQ NO.4)， 

Cecropin A成熟肽基因上游引物序列为5’-ACGAAGTTGTTGGGGATGGTTGAAAAAAATCGGCA(SEQ NO.5)， 

Cecropin A成熟肽基因下游引物序列为5’-CACTCGACTTAACCCTTTAATGTGGCGG(SEQ NO.6)。 

本发明所述的引物可以由本领域常用的方法合成。 

本发明所述的RT-PCR扩增反应是本领域常用的反应，可以按照常规条件进行。 

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可以在常规条件下进行，或者按照制造厂家提供的条件进行。 

本发明具有以下优点：