[发明专利]一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌及该菌种发酵生产纳豆激酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，尤其是一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌及其发酵生产纳豆激酶的方法。

背景技术

纳豆激酶是一种由纳豆芽孢杆菌产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，具有较强的溶栓特性，利用固态发酵方式产纳豆激酶，具有简单易行、成本低廉等特点。纳豆激酶，可直接分解血栓，每克湿纳豆溶栓效果相当于尿激酶1600IU。纳豆激酶对血栓的作用时间长达8-12小时，而尿激酶作用时间只有30分钟。尿激酶只能注射，纳豆激酶即可注射也可口服，而且可以在毛细血管中发挥作用。纳豆在日本已食用1000年，是一种安全的食用血栓预防剂。目前，利用枯草芽孢杆菌发酵产纳豆激酶的培养基种类很多，大都成本比较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌及该菌种发酵生产纳豆激酶的方法，本方法以豆粕为原料利用枯草芽孢杆菌固态发酵产纳豆激酶。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌，名称为TK-1，分类名称Bacillius subtilis，保藏编号为：CGMCC No.4731，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

一种利产纳豆激酶枯草芽孢杆菌发酵生产纳豆激酶的方法，发酵培养基包括豆粕。

而且，所述发酵培养基为：豆粕∶水的重量比为1∶1-2，pH6.5-7.5，豆粕用水浸泡3-4h。

而且，发酵培养基确定为：豆粕∶水的重量比为1∶1.2，pH7.0，豆粕用水浸泡3-4h。

而且，所述发酵培养基灭菌为：经110℃高压灭菌20min。

而且，发酵的接种与培养条件为：以5-15％的种子液接种量，将产纳豆激酶枯草芽孢杆菌TK-1(CGMCC No.4731)种子液接入发酵培养基中，并搅拌，培养温度30-45℃，培养箱湿度60-70％RH，培养24h。

而且，发酵的接种与培养条件为：以10％的种子液接种量，将种子液接入发酵培养基中，搅拌，培养温度37℃，培养箱湿度65％RH，培养24h。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明中的枯草芽孢杆菌以豆粕为原料固态发酵产纳豆激酶，豆粕的价格就比较低，且豆粕中蛋白质含量很高，利于菌体的生长，获得的纳豆激酶酶活最高达到5670FU/g干基，活菌数最高可以达到7*10⁹cfu/g。

2、本发明以食品级豆粕为主要原料发酵产纳豆激酶，豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品，含蛋白质40-50％，其主要成分还有氨基酸，丰富的微量元素和较少含量的脂肪，含水量一般在10％-20％，丰富的营养成分可以满足纳豆芽孢杆菌生长及产酶的需要，目前国内还未有只以豆粕为原料利用纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶的记载。

附图说明：

图1本发明枯草芽孢杆菌液态种子液生长曲线；

图2本发明枯草芽孢杆菌固态培养基生长曲线；

图3本发明枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕产纳豆激酶曲线测定。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一种产纳豆激酶枯草芽孢杆菌，名称为TK-1，分类名称Bacillius subtilis，保藏编号为：CGMCC No.4731，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1、斜面培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，pH7.0～7.2，121℃灭菌20分钟，培养条件：37℃培养48h。

菌株枯草芽孢杆菌TK-1在斜面培养基上37℃温度下培养48小时，在斜面试管中加入20ml无菌水，用接种环刮取少量菌苔于无菌水，振荡混匀，制成菌悬液，取1ml菌悬液接种于盛有99ml液态种子培养基的500ml锥形瓶中，于37℃，150rpm摇床上培养8小时，获得种子液。

2、种子培养

液态种子液培养基：蛋白胨1％，葡萄糖2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，pH7.0～7.2。培养条件：取斜面保存的枯草芽孢杆菌接种于液态种子液培养基，37℃，150rpm培养，每两小时取样600nm条件下测OD值。对数生长期在6-16h。确定接种发酵培养基的时间为8小时。并测定生长曲线，见图1。

3、固态培养(发酵培养)