[发明专利]多拷贝增味肽表达基因的构建及表达

说明书

技术领域

本发明涉及一种分子生物学技术构建重组DNA以在毕赤酵母发酵液中获得增味肽(Enhance Flavor Peptide，EFP)的方法。

背景技术

增味肽是一种从β-酪蛋白中水解得到的风味活性肽，它可以作为原料或是添加到各种食品中来提升食品的苦味、咸味、甜味以及鲜味，味道鲜美，可以增进食物天然口感。并且它还能抑制血管紧张素分泌、抑制组织蛋白酶B活性和抗真菌的生物活性。所以对EFP的研究是非常有意义的，寻求一种廉价的生产方式也必将迎来广阔的市场前景。

毕赤酵母是一个理想的外源蛋白表达体系，它具有真核生物表达系统的特点，能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工；能进行大体积高密度连续发酵培养；自身分泌蛋白少等优秀的特点。诱导毕赤酵母表达系统已经实现了400多种蛋白的表达，并且广泛地应用在工业大规模生产和实验研究中。

随着分子生物学技术的发展，利用重组DNA技术改造微生物使其合成分泌目标蛋白已经成为一种经济的生产方式。

本发明所采用的巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统是近年来发展的一种优秀的真核表达系统，与传统的大肠杆菌和酿酒酵母表达体系相比，其具有的诸多优势使之研究价值及应用价值不断体现。其最大特点是维持代谢低，能进行高密度发酵。自20世纪70年代以来，巴斯德毕赤酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经相当成熟，经发酵后细胞干重可高达160g/L，而且有研究表明，发酵生产的菌体含量和外源蛋白的表达水平具有一定的正比关系。毕赤酵母对外源蛋白的翻译后加工(糖基化、二硫键的形成、折叠)和高等真核生物非常相似，使得外源蛋白能够形成正确的空间构象，不但使表达的蛋白具有很好的生物活性，而且对蛋白的分泌十分有利。外源基因的整合非常稳定是此表达系统的另一个特点。毕赤酵母的生长和对外源蛋白的表达可以在廉价的合成培养基中进行，另外毕赤酵母自身的分泌蛋白很少，有资料表明，分泌的外源蛋白可以占总分泌蛋白的30％以上。因此，十分有利于分泌蛋白的纯化。

综上，本发明旨在毕赤酵母体系中表达目标增味肽。

发明内容

本发明的目的之一在于克服上述现有技术之不足，提供一种含有多拷贝增味肽表达基因的重组质粒载体及构建方法。

本发明的目的之二是提供一种由上述表达载体导入毕赤酵母构成的工程菌株。

本发明的目的之三是提供上述工程菌株在制备多串联拷贝的增味肽中的应用。

为了实现本发明的目的，首先按照毕赤酵母翻译表达的密码子偏爱性设计出含有6拷贝EFP的表达基因片段，该片段合成的双链插入到常见的载体上，通过体外连接构建成含多拷贝EFP表达基因，通过相应限制性酶切位点整合入适当的表达载体(pPIC9)，再导入毕赤酵母构成重组DNA，使其表达多串联拷贝的EFP。

本发明目的产物EFP表达基因的获得是根据毕赤酵母翻译表达的密码子偏爱性自行设计并由生工生物技术有限公司负责合成的。其中，6拷贝增味肽(Enhance Flavor Peptide，EFP)的表达基因片段，如序列表序列1所示；24拷贝增味肽的表达基因片段，如序列表序列2所示。

其中，6拷贝EFP的表达基因设计方法如下：

第一、按照毕赤酵母翻译表达的密码子偏爱性设计出含有6拷贝EFP的表达基因片段，6拷贝的EFP表达基因头尾相连，每个表达片段之间不含其他序列；

第二、在上步6拷贝EFP表达基因的上游位置加入Xho I限制性酶切位点，下游位置加入Sal I限制性酶切位点；

第三、在上步的基因片段的Xho I限制性酶切位点的上游位置加入EcoR I限制性酶切位点，Sal I限制性酶切位点的下游位置顺序加入6×His编码基因、Not I限制性酶切位点和TAA终止密码子，最终得到如序列表序列1所示含有6拷贝EFP的表达基因片段。24拷贝EFP的表达基因构建方法为：

第一、用Xho I或Sal I将以上合成构建的6拷贝EFP表达基因的载体酶切后线性化，产生粘性末端；

第二、用Xho I和Sal I将以上合成构建的6拷贝EFP表达基因的载体双酶切后回收包含6拷贝EFP、两端含有Xho I和Sal I粘性末端的小片段；

第三、将第一步和第二步得到的基因片段通过T4DNA连接酶进行连接，连接获得含有12拷贝、18拷贝、24拷贝或拷贝数为6的任意整数倍的EFP表达基因载体；