[发明专利]一种水稻中花11高效再生及转化体系建立的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及到一种水稻中花11高效再生和转化体系建立的方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是世界上分布最广，也是最重要的的粮食作物之一，其遗传转化一直受到广泛重视。籼稻(ssp.indca)和粳稻(ssp.japonica)是水稻栽培稻两个主要的亚种，在遗传转化方面差异明显。总的来说，籼稻胚性愈伤组织诱导系统较难建立，细胞分裂能力弱，转入选择培养基后愈伤组织生长缓慢，不易分化成苗。粳稻品种容易转化成功，转化频率高。中花11属粳稻品种，是近年来遗传转化常用的水稻品种之一。自1994年miniei等利用土壤杆菌介导转化粳稻成熟胚获得可育的转基因水稻植株后，农杆菌介导的水稻转化即成为了开展水稻研究的一项基本技术。

建立高效的组织培养再生体系是获得高效遗传转化效率的必备条件之一。在完善水稻再生体系研究中，对培养基种类、外植体选择、基因型、光照条件等研究报道较多。但是水稻作为一种喜温作物，温度对其组织培养再生也是一个非常重要的因素。人们在利用水稻成熟胚进行再生研究时常将培养条件设定为26～28℃，暗培养。2006年，Seiichi Toki等人发现，32℃，光照条件下培养1天的日本晴成熟种子即可用于农杆菌浸染，培养2天的种子即可从盾片处长出愈伤组织，3天便可见明显的愈伤组织，在此基础上，他们建立了一套适合于日本晴的农杆菌早期浸染水稻成熟胚快速转化体系，一个月内就可获得转基因植株，转化效率为28.6％。这一研究极大缩短了常规水稻转化需要3～4个月的周期，但转化效率还有待提高。苏益等为验证Seiichi Toki等人的快速浸染转化法是否适用于中花11成熟胚转化，在愈伤组织预培养时间、浸染时间和凝固剂等方面做了改进，最终在40天内就获得了水稻转基因植株，转化效率和再生效率分别达到了71.3％和57％。相比Seiichi Toki等人转化效率提高42.7％，但再生率还有待提高。且直接浸染带有愈伤组织的成熟胚，在愈伤组织和种子相连处的间隙里容易包裹农杆菌，导致在共培养后的清洗过程中，农杆菌除去不彻底，筛选培养时极易染菌。于洋等为了探索在较高温度诱导和继代环境中能否提高水稻再生效率，以“超2-10”和“中花11”两种粳型水稻成熟胚为材料，设置了26℃和36℃的温度环境，结果表明，36℃培养更有利于成熟胚诱导的愈伤组织早期生长，再生率明显比26℃培养时高。众多研究表明，适当提高温度不仅有利于水稻愈伤组织的快速分裂生长，加快转化速度；而且可有效抑制共培养时农杆菌的过度生长，从而提高转化效率。

影响农杆菌转化效率的因素颇多，如菌株和载体、水稻基因型、转化受体、共培养条件(酚类化合物添加、菌液浓度、共培养时间等)等，其中研究主要集中在对于共培养条件的优化。在菌液浓度方面，目前的文献研究使用的农杆菌菌液OD₆₀₀常为0.1～1.5，转化率约为50％～80％(粳稻)。但本发明中使用的菌液OD₆₀₀为0.05～0.1，转化效率高达90％以上，且再生植株经过检测，阳性率为100％；共培养方面，在共培养基上添加一张无菌滤纸，水稻愈伤组织周围农杆菌的生长速度可以被有效地控制，使得共培养后除菌可以温和地进行，从而提高抗性愈伤组织得率；在共培养温度方面，农杆菌具有最强浸染力的生长温度并不是其最适生长温度，而是在较缓慢生长温度条件下，因而，多控制在19～25℃之间。

在愈伤组织再生阶段，分化率低一直是制约水稻遗传转化的一个主要因素。粳稻品种直接分化率低于10％，且耗时长。郝文媛等实验结果表明，通过10～30天的预分化培养不但可以改变愈伤组织的生长状态，而且可以显著提高愈伤组织的分化频率。

AtCPR5基因是一个多效性基因，在拟南芥抗病性、细胞增殖、细胞衰老、细胞死亡、蔗糖的感受、茉莉酸途径、脱落酸途径、膜蛋白的编辑、细胞壁形成等方面发挥重要的作用。AtCPR5基因最初是在筛选抗病性的拟南芥突变体中发现的，主要对两种致命病原体——梨枯病原体和寄生性病原菌卵菌产生组成性的抗病性。此外AtCPR5基因还影响细胞壁的形成及表皮毛的发生，这种隐性突变体植株矮小、叶片光滑、表皮毛分叉减少、细胞壁纤维素结晶区减少，内源SA含量高。目前对AtCPR5基因功能的研究主要集中在抗病性方面。而最近的研究发现AtCPR5与拟南芥的抗热性有密切关系，过量表达AtCPR5能提高拟南芥的耐热性，并阐明了其调节机制可能是通过上调热激蛋白minsp17.6的表达而间接提高了拟南芥的耐热性。

发明内容