[发明专利]一种产磷脂酶A2的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体涉及一种产磷脂酶A₂的工程菌，同时涉及一种含磷脂酶A₂基因的质粒，还涉及一种产磷脂酶A₂的工程菌的制备方法，该工程菌发酵生产的磷脂酶A₂在植物油脂脱胶及溶血磷脂制备等方面的应用。

背景技术

磷脂酶A₂(Phospholipase A₂，PLA₂)，即磷脂-2-酰基水解酶(EC 3.1.1.4)，是磷脂分解代谢中起重要作用的酶。它催化甘油磷脂C-2位酯键的水解反应，生成溶血磷脂和脂肪酸。

磷脂酶A₂最早由Belfanti于1924年用生物化学方法从肝脏组织中分离出来。后来，人们从肾脏、前列腺等其他组织中都分离出此酶。武内忠男于1952年在光镜下用组织化学法证明了磷脂酶A₂的存在。

不同来源的磷脂酶A₂分子量差异较大。例如，来源于链霉菌、蛇毒、、蜂毒、胰腺等外分泌型的磷脂酶A₂的分子量一般在13KD-18kD，其活性依赖Ca²⁺离子的存在。存在于犬/人的心肌胞浆内的磷脂酶A₂分子量为40kD，而存在于鼠肾及人血小板胞浆内的磷脂酶A₂的分子量则达到85kD。

现在已有几十种不同来源的磷脂酶A₂的一级结构被阐明，氨基酸顺序已测出。例如，猪的磷脂酶A₂，酶原的活力很低，通过胰蛋白酶除去氨基端七肽后能转变成活性形式。

一些来源比较接近的磷脂酶A₂，同源性较高，例如江浙蝮蛇毒中的酸性、中性和碱性磷脂酶A₂，其同源性高达50％以上，含有14个Cys残基，组成七对二硫键。这几种磷脂酶A₂虽然都有将磷脂水解成为溶血磷脂的功能，但在溶血活性、神经毒素活性、抑制血小板聚集等功能方面却有很大不同。

眼镜蛇毒的磷脂酶A₂已经分离纯化得到了均一产物，对热稳定，分子量为11,000D，分子内含有一个组氨酸残基和一个色氨酸残基，5-6个二硫键。猪胰的磷脂酶A₂与蛇毒 磷脂酶A₂的同源性也很高，含有12个Cys残基，组成六对二硫键。

来源不同且一级结构上差异很大的磷脂酶A₂，却都能水解甘油磷脂上C-2位脂肪酸，行使着相同的功能，分析其蛋白质的一级结构和高级结构，其相同或相似的结构应该是其行使磷脂酶A₂催化功能所必需的。

通过对蜜蜂毒腺磷脂酶A₂一级和高级结构的研究发现，蜂毒磷脂酶A₂不仅在一级结构中半胱氨酸的间距、Ca²⁺结合区域、与催化活性中心有关的几个氨基酸的位置上与来源于其他生物的磷脂酶A₂相似，这些应该是磷脂酶A₂的结构特征。

蛇毒磷脂酶A₂的研究发现，磷脂酶A₂的酶活性与质子传递系统、Ca²⁺结合环及疏水通道等有关。其中质子传递系统由His-48、Asp-99、Tyr-52和Tyr-73等氨基酸组成；Ca²⁺结合环由25-35位氨基酸组成；疏水通道由高度保守的疏水性残基Leu-2、Phe-5、Met-8、Ile-9、Tyr-22、Cys-27、Cys-29、Cys-45、Tyr-52、Ala-102、Ala-103和Phe-106等组成。江浙蝮蛇毒酸性磷脂酶A₂(APLA₂)和尖吻蝮蛇毒酸性磷脂酶A₂(A.aAPLA₂II)的这三个因素基本相同(只有个别氨基酸残基不一致)但酶活性差别较大。

有些来源差异大的的磷脂酶A₂，尽管分子量接近，但其一级结构的同源性却很低，例如链霉菌与猪胰磷脂酶A₂的同源性小于10％，链霉菌磷脂酶A₂的一级结构只有4个Cys残基，但却都拥有与蛇毒磷脂酶A₂相似的质子传递系统、Ca²⁺结合环和疏水通道。