[发明专利]3,4-二氯异香豆素在制备抗球虫病药物中的用途

说明书

技术领域

本发明公开了3,4-二氯异香豆素在制备抗球虫病药物中的用途，可以抑制柔嫩艾美耳球虫对宿主细胞的侵入，用于球虫病的预防和治疗，属于医学制药技术领域。

背景技术

球虫病一直是养鸡生产中主要控制和治疗的疾病之一，尤其是集约化养鸡方式的大面积推广及应用之后，更成为常见多发性疾病，其中以柔嫩艾美耳球虫最为严重。抗球虫药物可以说是饲料中必须添加的药物之一，但是近年来由于抗药性的问题，及药物残留等问题，使得抗球虫药物的研究进入了一个瓶颈的阶段。顶器门寄生性原虫生活史复杂，因此对其侵入机制的研究一直困扰着研究者。柔嫩艾美耳球虫的细胞膜内含有一种丝氨酸蛋白酶，即Rhomboid蛋白，它的酶活性的发挥是虫体侵入宿主细胞的关键。3,4-二氯异香豆素是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，它是否能够抑制柔嫩艾美耳球虫Rhomboid蛋白活性，从而阻碍虫体侵入宿主细胞并未见有报道。

发明内容

本发明提供了3,4-二氯异香豆素在制备抗球虫病药物中的用途，为一种新的医用用途，用于球虫疾病的预防和治疗。

本发明的技术方案是这样实现的：

体外分离鸡肾细胞，对其进行原代细胞培养。同时将3,4-二氯异香豆素稀释成不同终浓度的培养液。然后提取柔嫩艾美耳球虫子孢子，将各浓度溶液平均分成两部分，一部分在加入细胞培养板前与子孢子作用，然后洗去药物后接入细胞；另一部分与子孢子一同接入细胞，培养一定时间后，用Hank's液洗去药物，甲醇固定染色，在显微镜下计数。观察不同浓度的3,4-二氯异香豆素对子孢子的侵入、裂殖体和卵囊形成的影响。

以下药理实验证明本发明的治疗效果：

体外进行鸡肾细胞的原代培养；然后提取柔嫩艾美耳球虫子孢子，将3,4-二氯异香豆素通过DMSO（二甲基亚砜）溶解，配制成100μM的溶液，在向细胞培养板中加入3,4-二氯异香豆素时，分别稀释成终浓度为1 μM、10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM的培养液。

将各浓度溶液平均分成两部分，一部分在加入细胞培养板前与子孢子作用，然后洗去药物后接入鸡肾细胞；另一部分与子孢子一同接入鸡肾细胞。培养一定时间后，在显微镜下对子孢子形成的第一代裂殖体、第二代裂殖体以及子代卵囊进行计数，具体的判定标准如下：抑制剂对细胞的毒性，以细胞脱落为标准。

采用兼顾第一代裂殖体数量、第二代裂殖体数量和卵囊数量的原则，即以第一代裂殖体数量为第一指标，判断3,4-二氯异香豆素对子孢子侵入细胞的影响；

以第二代裂殖体数量为第二指标；判断3,4-二氯异香豆素对E. tenella的治疗效果（第二代裂殖阶段是造成鸡只死亡的主要阶段）；

以卵囊数量为第三指标，判断3,4-二氯异香豆素对病原控制的效果（随患鸡粪便排出的卵囊是健康鸡群的传染源）。

第一代裂殖体数：子孢子接种后48 h，在100倍倒置显微镜下观察并计算各组的第二代裂殖体数，每组计算20个视野；

第二代裂殖体数：子孢子接种后108 h，在100倍倒置显微镜下观察并计算各组的第二代裂殖体数，每组计算20个视野。

卵囊形成数：子孢子接种后8 d，同样方法统计子代卵囊数量。

1、第一代裂殖体数量

将E.tenella子孢子接种于鸡肾细胞48h后，通过倒置显微镜对第一代裂殖体数量进行统计，如图1所示，随着丝氨酸蛋白酶抑制剂3,4-二氯异香豆素浓度的增加，共培养组的第一代裂殖体数量呈逐渐减少的趋势，而提前处理的这一组则变化幅度不大，趋势不明显。与空白空白对照组相比，共培养组在3,4-二氯异香豆素浓度20μM和30μM时差异极显著（P<0.01），40μM和50μM时差异显著(P<0.05)，而前处理组则与空白空白对照组无明显差异。当3,4-二氯异香豆素浓度达到40μM和50μM时细胞出现一定的脱落现象，可见3,4-二氯异香豆素在40μM时抑制了细胞的生长与代谢，从而导致了细胞的死亡。

结果表明，20μM 的3,4-二氯异香豆素浓度可以有效抑制体外球虫对鸡肾细胞的侵入。

2、第二代裂殖体数量