[发明专利]一种聚乙二醇化的葡激酶突变体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于：是将野生型葡激酶的71-87氨基酸序列之中的任一亲水性氨基酸进行定点突变，将其替换为半胱氨酸，通过构建重组表达质粒，得到葡激酶突变体，然后使用甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇对葡激酶突变体中的半胱氨酸进行定点修饰，得到的聚乙二醇化葡激酶突变体。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于：聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)是将野生型Sak的K74替换为半胱氨酸，突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连，其中聚乙二醇的平均分子量为5000。

3.根据权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于：聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E75C-SP5)是将野生型Sak的E75替换为半胱氨酸，突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连，其中聚乙二醇的平均分子量为5000。

4.根据权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于：聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(R77C-SP5)是将野生型Sak的R77替换为半胱氨酸(简写为C)，突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连，其中聚乙二醇的平均分子量为5000。

5.根据权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于：聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(E80C-SP5)和Sak(E80C-SP10)是将野生型Sak的E80替换为半胱氨酸，突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连，其中聚乙二醇的平均分子量分别为5000和10000。

6.根据权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体，其特征在于：聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(D82C-SP5)是将野生型Sak的D82替换为半胱氨酸，突变体中半胱氨酸的侧链硫原子与甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇通过共价键相连，其中聚乙二醇的平均分子量为5000。

7.一种聚乙二醇化葡激酶突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)以野生型Sak的表达质粒pBV-Sak为模板，使用突变引物进行PCR扩增，直接得到表达质粒，并转化感受态大肠杆菌DH5α，转化产物涂布在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证是否发生预计位置的突变；

(2)Sak突变体的表达质粒转化大肠杆菌得到各个突变体的工程菌，通过升高培养温度诱导Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)基因的表达，表达产物以胞内可溶性蛋白的形式存在；

(3)发酵技术：以M₉CA培养基培养Sak突变体工程菌，pH＝6.5-7.5，温度37℃时，培养菌体，在42℃时诱导表达目的蛋白；

(4)Sak突变体工程菌发酵后，离心收集菌体，重悬后超声破碎菌体，离心并收集上清液，用色谱法纯化产品，色谱方法的顺序为阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱和阴离子交换色谱，得到高纯度的葡激酶突变体Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)；

(5)所得到的葡激酶突变体Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)与过量的二硫苏糖醇反应后，Sephadex G-50层析柱除去未反应的二硫苏糖醇，然后，葡激酶突变体Sak(K74C)、Sak(E75C)、Sak(R77C)、Sak(E80C)、Sak(D82C)与分子量为5000或10000的甲氧基马来酰亚胺聚乙二醇室温下反应，用色谱法纯化产品，色谱方法的顺序为阳离子交换色谱、凝胶过滤色谱，得到高纯度的聚乙二醇化葡激酶突变体Sak(K74C-SP5)、Sak(E75C-SP5)、Sak(R77C-SP5)、Sak(E80C-SP5)、Sak(E80C-SP10)、Sak(D82C-SP5)。

8.一种如权利要求1所述的聚乙二醇化葡激酶突变体的应用，其特征在于作为血栓栓塞性疾病的溶栓治疗药物应用。