[发明专利]一种高活性蚓激酶的制备方法

权利要求书

1.一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将蚯蚓洗净，加入磷酸盐缓冲液，捣碎，过滤取滤液，得到蚯蚓粗蛋白溶液，再进行离心，取上清液；

(2)将步骤(1)所得上清液进行超滤，得到粗酶液；

(3)4℃下，向粗酶液中加入硫酸铵，使粗酶液中硫酸铵的饱和度达到20-45％，静置3.5-4h，然后离心，取上清液；往上清液中继续加入硫酸铵，使上清液中硫酸铵的饱和度增加到50-75％，静置3.5-4h，然后离心，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，得到酶液；

(4)将酶液上Sephadex G-25柱，以磷酸盐缓冲液为洗脱液洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，每管10ml，测定每管洗脱液的OD_280nm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管洗脱液；

(5)将步骤(4)得到的洗脱液上DEAE-纤维素柱，然后用0.1M的NaCl溶液进行淋洗，再用0.1-0.6M的NaCl溶液进行梯度洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，每管10ml，测定每管洗脱液的OD_280nm值，计算每管洗脱液中的蛋白质含量，合并出现峰值的各管洗脱液，得到高活性蚓激酶；

步骤(4)和(5)所述洗脱的流速为2ml/mim。

2.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述蚯蚓是赤子爱胜蚓。

3.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)和(3)所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.8、浓度为100mmol/L，加入前在4℃预冷。

4.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述磷酸盐缓冲液按与蚯蚓1∶1的体积质量比加入。

5.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述过滤是用四层纱布过滤。

6.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)或(3)所述离心是在4℃下6000rpm离心10-15min。

7.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述超滤采用STM-DGM多功能膜分离系统，工作温度：25-28℃，料液pH值：7.8，压强：0.5-0.7MPa，膜通量：9-12L/(m².h)，浓缩比：5.0∶1-5.2∶1。

8.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.8、浓度为5mmol/L。

9.根据权利要求1所述一种高活性蚓激酶的制备方法，其特征在于：步骤(5)所述DEAE-纤维素柱是DEAE-Cellucose-52。