[发明专利]H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，确切地说是H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒 

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种禽类的急性、烈性传染病，除了可感染禽类外，还可感染人、猪和马等多种动物，被OIE列为A类传染病。禽流感病毒(AIV)属于A型流感病毒，禽流感病毒(AIV)变异频繁，血清亚型众多。根据HA抗原性差异分为16个HA亚型。抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疾病。 

高致病性禽流感主要是由H5或H7亚型AIV引起的，潜伏期极短，突然爆发，多不见任何临床症状而突然死亡，发病率和死亡率可高达100％，给养禽业带来严重经济损失，另外还可感染人，甚至导致死亡。据世界卫生组织(WHO)报道，截止到2009年5月22日，全世界共有H5N1亚型禽流感病毒感染人429例，死亡262例；我国共有感染病例38例，死亡25例。目前，我国部分地区以H9亚型为主的中低致病力禽流感的流行，能造成鸡产蛋量下降，给我国养禽业造成很大的经济损失，这一点已引起国内各界的广泛关注。所以早期快速检测无疑是预防、控制禽流感的前提条件，尤其是针对H5、H7和H9亚型的AIV。病毒分离、血清学试验至今仍是诊断AI和对AIV进行定型普遍采用的方法。但这些方法操作繁琐复杂；难以对AI进行快速诊断；十分不利于AI的防治。自从美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(PCR)以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之。聚合酶链式反应(PCR)是一种体外基因扩增技术，可以在数小时内对某段基因进行扩大数百万倍。该技术特异性强、敏感性高。为AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方法。 

多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR)技术其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。但与多个单项PCR相比，多重PCR具有以下显著的优点：高效性，它可在同一PCR管内同时扩增多个靶基因，或对有多个型别的目的基因进行分型；系统性，多重PCR很适宜于多种病原体的同时检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌和无芽孢厌氧菌的同时检测；经济简便性，多个靶基因在同一反应管内同时扩增，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。自从1988年首次报道以来，作为一种临床和实验室快速筛选技术，多重PCR已经成功应用到很多领域，如基因缺失、突变和多态性的分析、RNA检测 和基因组测序分析。 

各类PCR成功的关键在于设计出合理的引物，合适的引物是决定PCR扩增特异性和敏感性的关键。多重PCR对引物的要求更加严格，以便同时检测出多种病原微生物。 

多重PCR的各对引物必须具有相近的退火温度，使得所有的靶位点可以用相同的PCR程序在单个的反应中得到有效的扩增。而其之间不能形成稳定二聚体和发夹结构。同时保证了扩增产物的大小能够通过电泳分开。 

虽然有很多能帮助设计引物的软件，例如“Premier Primer 5.0”、“Olio 6”、“V ector N TI Suit”、“DNAsis”和“DNAstar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果并不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上，还要各软件搭配使用。 

尽管上述软件能够对帮助设计引物，但它毕竟是在科技人员大量研究成果的基础上，设计出的固定程序。人工分析、实际操作经验是必不可少的。可靠的多重PCR检测体系，还要通过科技人员大量试验验证、筛选。 

发明内容

本发明的目的是提供一种利用多重RT-PCR可同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒。 

H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒，它是由RNA反转录体系，以及PCR反应体系组成，其中引物为： 

P5-1：5′-CCAATCCAGCCAATGACC-3 

P5-2：5′-TCTATGGCAACCCTTCTT-3 

P7-1：5′-GAGTCAATGGACTTCACC-3′ 

P7-2：5′-AGGTTCGGTCTGCTCGCT-3′ 

P9-1：5′-TCTATGGCAACCCTTCTTGT-3′ 

P9-2：5′-TATAACCCTGACCAACCTCC-3； 

所述的反转录体系还包括引物P5-1、P7-1和P9-1；