[发明专利]鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测技术，具体涉及一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

河南省郑州某养殖场2004年5月发生了以腹泻和生长迟缓为主要症状的疑似IB疾病，感染鸡主要表现精神沉郁，下痢，生长缓慢及抵抗力下降，发病率为100%，死亡率达10% 以上，感染鸡群的生产性能显著降低。调查中显示，与鸡舍相距仅150米左右处有一个1700只的肉鸭群，在第一批鸡发病前约10天左右鸭群发生过类似症状的疾病。死亡鸡病变主要为小肠出血，肠壁变薄，有的有溃荡，小肠绒毛脱落,腺胃乳头肿大、粘膜脱落，有的肌胃和腺胃交界处有出血，肌胃有出血或溃荡，肾脏肿大，呈“花斑肾”，肺脏无明显变化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎缩；病鸭剖检以肾脏肿大，苍白兼有出血、腿肌及肝脏出血为主要特征。在同地区的其他鸡场也发生了同样症状的疾病，虽然经过多种IBV疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技学院动物科学学院开展了对该疫病的研究工作，结果从发病鸭体内分离到一株病毒，鉴定为IBV，命名为鸭源性冠状病毒ZZ2004株（保藏编号：CGMCC NO.3842），其专利文献公开号为CN 101906404A，此为首次有关家鸭感染IBV的报道。本病毒分离株ZZ2004来自鸡鸭混养的养殖场，其不仅引起鸡的大批发病及死亡，还感染了鸭群，严重影响了家鸭的生长发育并导致鸭的死亡。与其它禽类的冠状病毒相比，鸭源性冠状病毒ZZ2004变异的程度较大，对动物的感染谱更广。

目前，国内外已建立了许多IBV相关的诊断技术，主要分为抗体检测和抗原检测两大类。抗体检测方法包括间接免疫荧光法、ELISA法、免疫过氧化物酶单层细胞试验、中和试验等。目前所有针对抗体的检测方法都无法区分免疫鸡群和感染鸡群，从而影响疫病的及时、有效防控。而抗原检测方法则结果较直接，能明确病毒感染。针对IBV抗原检测的方法主要有RT-PCR法、病毒分离、免疫组化等，各方法均存在一些不足之处。例如，病毒分离方法耗时、费力；免疫组化方法操作繁琐，影响因素较多，并且结果判断具有一定的主观性；RT-PCR方法对检测人员实验操作技能要求较严格，且成本较高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、精确度高、操作简便、检测快速的鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒，并公开了其应用方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒，包括洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液，其还包括：

（1）包被抗体的酶标板：以抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗作为包被抗体，用包被液将单抗稀释到10μg/ml，每孔加入100μL，4℃冰箱中过夜，用洗涤液PBST洗涤2～4次，再向酶标板中加入5%（g/mL）的BSA封闭液，100μL/孔，37℃反应2h，洗涤液PBST洗涤2～4次；

（2）捕获抗体：兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗；

（3）酶标抗体：HRP标记的羊抗兔IgG。

所述抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的单抗由保藏编号为 CGMCC NO.4171的杂交瘤细胞株3H10分泌制得。

所述兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗的制备方法如下：

将病毒进行纯化，选择2.0～2.5㎏之间的大白兔进行四次免疫，时间分别为第1天，第14天，第28天和第30天，第4次免疫后一周进行心脏采血，分离血清，即得兔抗鸭源性冠状病毒ZZ2004株的多抗。

所述鸭源性冠状病毒夹心ELISA试剂盒的应用方法，包括以下步骤：

（1）加待检样品：取试剂盒中的包被抗体的酶标板，向其中加入经过处理的待检样品，100μL/孔，同时分别设立阳性对照和阴性对照，37℃下反应25～35min，洗涤液PBST洗涤2～4次；

（2）添加捕获抗体：取试剂盒中的捕获抗体，按1:100倍稀释后加入到上述酶标板中，100μL/孔，37℃反应25～35min，洗涤液PBST洗涤2～4次；

（3）添加酶标抗体：取试剂盒中的酶标抗体，用洗涤液PBST按照1:1000的比例进行稀释并混匀，100μL/孔， 37℃下反应25～35min，以洗涤液PBST洗涤2～4次；

（4）显色：加入TMB显色液，100μL/孔，在室温下显色8～12min，用2M的H₂SO₄为终止液终止显色；

（5）测OD值：用酶标仪进行测量，测OD值。

所述待检样品的前处理方法如下：