[发明专利]超级细菌新德里金属依赖型β-内酰胺酶NDM-1的表达纯化及β-内酰胺酶NDM-1的晶体结构

说明书

技术领域

本发明涉及对超级细菌新德里金属依赖型β-内酰胺酶NDM-1进行基因工程改造以获得在大肠杆菌中的高效表达、纯化和结晶的方法，以及超级细菌新德里金属依赖型β-内酰胺酶NDM-1第47位到第270位氨基酸的三维晶体结构及其在药物筛选及药物设计方面的应用。 

背景技术

超级细菌NDM-1在2010年8月经Lancet杂志特别报道后，引起了全世界广泛的关注，美国3个州和加拿大也出现感染个案；医学界表示，细菌正在蔓延，但未知蔓延速度有多快，呼吁各国设立监控系统，检测入院人士，合力追踪病菌蔓延情况，并呼吁民众注意个人卫生，不要滥用抗生素。至2010年9月，英国有超过70人感染这种NDM-1超级细菌，印度和巴基斯坦的感染人数则超过170人。比利时、荷兰、奥地利、法国、德国、肯尼亚、澳大利亚、日本等国都出现了感染个案。因此，解析NDM-1的三维结构不仅对揭示其复制机制具有重要的科学意义，而且对开发抗NDM-1药物具有重要价值。 

NDM-1，指的是New Delhi metallo-β-lactamase 1(新德里金属-β-内酰胺酶)。这种酶可分解β-内酰胺环结构，因此可使任何含β-内酰胺环结构的蛋白质失效。由于目前为止临床最常用的抗生素，包括青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素，都含有β-内酰胺环结构，因此携带这种酶的细菌可以使几乎所有抗生素失效(即只要该抗生素含有β-内酰胺环结构)。超级细菌NDM-1则是指携带编码NDM-1酶的基因的细菌。至今已发现一些克雷伯氏肺炎菌、大肠杆菌和少数鲍曼不动杆菌的菌株携带有此能编码新德里 金属-β-内酰胺酶1的基因，而该基因存在于细菌的质粒(一种容易在细菌间发生基因信息交换的环状DNA)上，亦即此基因可以通过基因水平转移以从一个菌株转移到另一个菌株中，使原本对抗生素敏感(没有耐药性)的菌株获得耐药性。 

最早报道的产NDM-1细菌为肺炎克雷伯菌，于2009年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现，对所有β-内酰胺类抗菌药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对粘菌素敏感，深入研究发现这株细菌携带一种新型金属β-内酰胺酶，并根据患者可能感染地点命名这种酶为NDM-1，其后还在这名患者粪便中分离到产NDM-1的大肠埃希菌。 

NDM-1属于B类金属β-内酰胺酶(MBL)家族，临床分离细菌大多能产生β-内酰胺酶，已经确定的β-内酰胺酶有数百种；各种酶分子结构和对β-内酰胺类水解能力存在较大差异，一般根据分子结构分为A、B、C、D四大类，其中，A类，C类和D类的β-内酰胺酶结构上与丝氨酸β-内酰胺酶类似，通常他们的活性位点具有一个狭窄的纵形沟状结构，在沟的底部形成了一个空腹(氧阴离子袋)，这种疏松的构造容易弯曲，便于结合底物。由于β-内酰胺环上的羰基碳在结合β-内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其开环，进而引起β-内酰胺酶的分解。而B类金属β-内酰胺酶(MBL)在其活性部位大多含有锌离子，因此又称为金属β-内酰胺酶。其水解底物包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类等，表现为产酶细菌对这些药物广泛耐药。MBLs利用一个二价金属离子，分别与组氨酸或半胱氨酸结合，或同时与二者结合，并与β-内酰胺类抗生素的羰基碳的酰胺键相互作用，使其发生分解。MBLs主要对青霉素、头孢菌素、碳青霉稀类抗生素发挥作用，但对单内酰环类抗生素无效。MBLs最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小，其活性不被克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂所抑制，但可被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制。 

然而，尽管一些β-内酰胺酶抑制剂已经在临床上使用(如三唑巴坦)，但这些均被视为A类β-内酰胺酶抑制剂(如丝氨酸β-内酰胺酶)。因此，临床上仍然缺乏针对MBLs的抑制剂。而蛋白质结构的解析对揭示蛋白质 功能具有重大作用。这一结构的揭示也将对其功能研究具有重大意义。 

发明内容