[发明专利]小鼠原位左肺移植模型及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于医学动物模型技术领域，具体涉及一种小鼠原位左肺移植模型及其构建方法。

背景技术

在动物实验中，小鼠比大鼠有诸多优点，不仅试剂资源丰富、可选品系众多、实验消耗低，而且基因操控性更好，可以方便获得多种转基因和基因敲除品系。相对于其他小鼠肺病模型，例如呼吸机肺损伤、脂多糖吸入损伤，本模型所复制的急性肺损伤、慢性免疫损伤、肺纤维化过程具有起始点明确、背景噪声更易控制等优点。这些优点可满足一些实验设计的特殊要求，使其在肺移植领域以及病理生理学和免疫学等的一些基础研究领域具有更好的应用前景[1-2]。

1971年Asimacopoulos等报道了大鼠原位肺移植模型，Mizuta等1989年报道了套管法改良技术，将建模时间由4小时缩短到2小时之内[3-4]。此后，套管法大鼠原位肺移植模型很快取代犬、猪肺移植模型，成为最常用的单肺移植模型。随着基因敲除技术等新技术的成熟，小鼠原位肺移植模型有了现实而迫切的需求。大鼠和小鼠解剖结构相似，但由于体重相差悬殊（250g～300g vs. 25g～30g），小鼠原位肺移植对显微外科技术的要求更高。美国Washington University的研究者于2007年首次报道了小鼠原位肺移植技术，并于2009年报道了改良方案[5-6]。2009年，瑞士University Hospital Zürich的研究者报道了类似的模型制作方法[7]。截至2011年4月，仅此两家实验室报道过这项技术。小鼠原位肺移植模型的技术流程与大鼠模型一致，技术关键点在于如何处理比大鼠更为细微的肺门结构。尽管美国和瑞士的研究者都提出了各自的解决方案，但都没有达到“简便、可重复性好”的建模要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、可重复性好、效果优异的小鼠原位左肺移植模型及其构建方法。

本发明提供的小鼠原位左肺移植模型有下述方法构建获得。构建方法的具体步骤如下：

1、制备套管（cuff）

要求：左肺支气管、肺静脉、肺动脉所用套管分别由18/20G、20G、24G血管导管（angiocatheter）制备；支气管、肺静脉套管体长1.0mm，肺动脉套管体长0.5mm；套管延伸柄长1.0mm，宽度占1/4～1/3管壁周径。

操作：血管导管用砂纸打磨后，24G导管切成1.5mm小段，其余型号切成2.0mm小段；将显微血管镊的一个尖头插入小段管腔，以其内侧面为切割平面，用刀片横向和纵向切割，做出套管的延伸柄。

2、建立供肺灌洗系统 （perfusion system）

要求：稳定提供与正常肺动脉压相当的灌洗压力。

操作：依次连接50ml针筒、输液器、22G血管套管，针筒固定于15--25cm高度（例如为20cm），注入肺保存溶液（例如为30ml）的冰水混合物，并使其充满管路。

3、小鼠麻醉、气管内插管与机械通气

要求：适度麻醉，经口气管插管，建立机械通气；插管位置恰当，不损伤供肺及所属血管、支气管。

操作：腹腔注射麻醉。用“两端固定、中间拉开”法快速经口气管插管，小鼠上颚用橡皮筋固定于泡沫塑料板，胸骨上部用左手环指抵住，左手拇指和食指牵拉舌头，暴露声门；右手持20G血管导管接近声门，在其开启瞬间轻轻插入；连接呼吸机输出管路，根据小鼠体重大小提供0.5～1.0 ml潮气量，呼吸频率120～140/min。

4、供者手术，获取供肺

要求：完全灌洗清除供肺血管床内血液，在双肺半充气状态下完整取出心肺块；不损伤供肺及所属血管、支气管。

操作：建立机械通气后，胸腹正中切口开胸；将100U/0.1ml肝素钠稀释液在供者心尖处注入右心室；左手持显微蚊式钳夹住心脏下1/3左右处、但不上齿，小指勾住供肺灌洗系统的输液器下端、使22G导管尖端恰好抵在右心上；打开输液器控制装置，将喷涌肺保存液的22G导管插入右心室；用眼科剪迅速剪开膨胀的左右心耳、腹腔动静脉，使灌洗液和血液快速流出；两肺数秒钟之后变白，在半充气状态下用显微蚊式钳夹闭气管，自上而下锐性解剖，将心肺块完整取出，生理盐水冲洗后置于铺有纱布的培养皿中，肺保存液制成的冰块恰使纱布浸透。

保持灌洗流速和适当的双肺通气幅度、灌洗液流出畅通是保证供肺灌洗质量的三个要素。一旦灌洗初期未能将供肺血管床内的血液冲洗干净，则延长灌洗无益于改善灌洗质量。