[发明专利]一种提取纯化唾液DNA的方法

说明书

本申请是如下发明的分案申请：申请日为2009年8月5日、申请号为200910090336.0、发明名称为一种提取纯化DNA的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种提取纯化DNA的方法。

背景技术

DNA分离纯化是分子生物学实验中非常重要的操作，核酸的质量直接关系到后续操作能否顺利进行。生物学、法医学和基因组学的发展，强化了对从各种生物检材中获得核酸的复杂方法的需求。例如，脱氧核糖核酸提供了广泛的关于遗传起源和遗传多态性信息。这些信息可用于法医遗传学鉴定实践。

目前所存在的各种核酸纯化方法皆可分成以下两大类：液相纯化和固相纯化。在液相纯化中，核酸维持为液体状态，而杂质通过沉淀、离心被除去或者核酸被沉淀出来，而杂质被保留；在固相纯化中，核酸被结合到固相载体上，而杂质被选择性洗脱。例如，采用液相纯化来分离的DNA保留在液相中，而杂质被通过诸如沉淀和/或离心之类的方法除去。在固相纯化中DNA结合到固相载体上，而杂质如RNA、蛋白质和磷脂等被选择性洗脱。在DNA纯化中，如果起始材料包括细胞，液相方法和固相方法都需要细胞或病毒共破裂，或裂解步骤。破裂或裂解步骤产生与污染物如RNA、脂质、碳水化合物、蛋白质等混合的DNA。这种混合物还含有降解DNA的必须被除去和/或灭活以不感染产生基本上未降解的DNA的DNA酶。两个纯化大类以前都利用常规的方法，需要繁琐的步骤，且通常用到有害的试剂，现在也出现了更快速的提取方法，如Chelex-100法，仅需要较少的步骤，且通常较少的有害试剂。

Chelex-100法一种快速液相DNA纯化方法，Chelex-100是一种化学整合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力.能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质。通过离心除去Chelex-100颗粒，使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离，防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中，影响下一步的DNA分析，并通过结合金属离子，防止DNA降解。利用螯合剂去除生物样本中金属杂质而达到纯化的目的。该法首先用去离子水洗涤生物样本，加入螯合树脂的悬浮液56℃孵育一定时间，100℃孵育8分钟，然后通过离心去除杂质。该方法简单、快速(仅涉及到两种试剂的使用)。但该法提取得到的DNA纯度不够，不能满足微量DNA生物样本DNA提取纯化的要求。

固相提取方法近年来发展迅速，在核酸提取领域占有非常重要的地位。这类方法一般需要四个主要步骤：裂解细胞使细胞膜、核膜DNA破裂以释放DNA；释放的DNA与固相载体结合；杂质的洗涤；洗脱而得到纯化的DNA。对于固相DNA纯化，已使用了多种固相载体，如二氧化硅微球、薄膜过滤器、金属氧化物、胶乳沉淀、硅藻土、玻璃粉等。当核酸存在于在高浓度离液盐以及低的pH溶液中时，能够吸附到硅类介质表面，并在低盐高pH溶液中洗脱下来，从而达到提取纯化目的。Vogelstein直接使用玻璃粉从琼脂糖凝胶中提取到DNA，而Marko使用玻璃粉成功提纯质粒DNA。Boom等对该方法加以改进，用二氧化硅和硅藻土为固相吸附剂，用来提取纯化人血清或尿液中的微量病原体基因组DNA。该方法需要六步离心、五种试剂从全血种纯化DNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取纯化DNA的方法。

本发明提供的提取纯化DNA的方法，包括以下步骤：

1)预处理：将生物样品与预处理裂解液接触，去除生物细胞所粘附的固体物质，得到粗裂解液；

2)核酸吸附：将步骤1)得到的粗裂解液与裂解结合液以及磁珠悬浮液混合，DNA将与磁珠结合，形成了含有磁性纳米微球-DNA的复合体的溶液体系，收集所述溶液体系中的磁性纳米微球-DNA的复合体；

3)洗涤：将步骤2)得到的磁性纳米微球-DNA的复合体依次用洗涤液I、洗涤液II洗涤，然后用洗脱液溶出DNA，得到纯化的DNA。

上述步骤1)中，所述生物样品是血液、血斑、组织、阴道拭子、口腔拭子、唾液斑、汗液斑或脱落细胞时，所述预处理裂解液的pH为7.4-8.5，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质：10-100mM缓冲盐，0.5-5g/100ml的表面活性剂，1-100mM的螯合剂和50-150mM的可溶性盐，0.2-4mg/ml的蛋白酶K。